雷帕霉素联合2-DG对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响

谢 琨，申红远，郑焱华，李婷婷，魏香兰 西安市胸科医院 药物临床试验机构，陕西西安 7000； 空军军医大学西京医院 血液科，陕西西安7003

多发性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是骨髓中浆细胞克隆性增殖所致的血液系统恶性肿瘤，是血液系统中仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常见的恶性肿瘤[1]。随着免疫调节剂(来那度胺、泊马度胺等)、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米等)、抗CD38单克隆抗体、自体造血干细胞移植和嵌合抗原受体T细胞等在内的新治疗手段的应用，MM患者的治疗效果已经得到极大的改善。迄今为止，MM仍然是无法治愈的疾病，几乎所有MM患者最终都将演变为复发难治疾病状态[2]，这表明迫切需要新的治疗策略改善患者预后[3]。葡萄糖代谢异常是癌细胞的标志[4-5]。即使在氧气充足的条件下，癌症细胞仍主要通过糖酵解，而不是通过更有效率的线粒体氧化磷酸化利用葡萄糖，这种现象被称为Warburg效应[6]。因此癌细胞对糖酵解的偏好使靶向肿瘤细胞糖酵解途径的干预手段有希望成为抗肿瘤的方向[7-8]。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)由两种功能不同的多蛋白复合物组成——mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt信号通路的关键下游效应子，可调节和促进MM细胞生长增殖，应对化疗毒性使肿瘤细胞产生耐药。mTOR也可通过调节细胞葡萄糖代谢来影响细胞的生理活动[9]，这提示我们mTORC1抑制剂(如雷帕霉素)具有潜在抗MM作用[10]。单用mTORC1抑制剂的抗肿瘤作用有限，因为PI3K/AKT/mTOR通路中存在反馈激活机制，即mTORC1受到抑制时，ATK会活化，重新激活mTORC1信号，导致靶向mTORC1的药物疗效降低甚至出现耐药[11]。2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡萄糖的类似物，是使用最广泛的糖酵解抑制剂之一。单独应用2-DG阻断糖酵解对包括MM在内多种恶性肿瘤并没有产生明显的抗肿瘤效应，原因是肿瘤细胞可通过磷酸戊糖途径绕过2-DG的阻断作用继续为无氧糖酵解提供底物。这一过程中mTORC1发挥了重要作用，也反映了肿瘤细胞的代谢可塑性[12]。我们提出假设，mTOR在调节肿瘤细胞糖代谢过程中可能起作用，当mTORC1和糖酵解均被抑制时，两者在作用机制上存在互补，可能会产生协同的抗骨髓瘤作用。我们研究发现mTORC1抑制剂雷帕霉素和糖酵解抑制剂2-DG联用具有协同的抗肿瘤作用，使细胞周期阻滞、凋亡率增加。

材料与方法

1 细胞株 人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI8226购自武汉普诺赛公司，RPMI8226肿瘤细胞采用RPMI1640 培养液，10%(V/V)FBS，100 U/mL 青霉素，100 mg/L链霉素，37℃、5% CO2饱和湿度下培养。

2 主要试剂和仪器 Rapa 购于 Sigma 公司 (编号V900930，分子量914.17，纯度≥95%)，2-DG(编号I0697，分子量639.71，纯度＞99.0%)购于中国上海TCI公司，CCK-8购于中国上海尚宝公司(货号ST1008)，PI/RNase染色缓冲液(货号550825)和 Annexin V/碘化丙啶 (PI)检测试剂盒(货号556547)购于美国BD-PharminginTM公司(货号 ST1008)，抗 Bcl-2(货号 ab32124)、抗 P53(货号 ab26)、抗 Bax(货号 ab32503)、抗 CyclinD1(货号ab16663)、抗GAPDH(货号ab8245)抗体购于Abcam公司，CO2恒温培养箱(美国Thermo Scientific)，超净工作台(天津泰斯特公司)，酶标仪(南京德铁设备仪器公司)，倒置相差显微镜(德国Zeiss公司)，蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)，Omega Lum化学发光凝胶成像系统(美国Aplegen公司)，四色流式细胞仪(美国Beckman公司)。

3 细胞毒性试验 将 RPMI8226 细胞按 2 × 104/孔的密度接种于96孔板，每孔200 µL，分为单药 Rapa 组 (10 nmol/L、 20 nmol/L、 50 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L)、2-DG 组 (0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L)及两药联合作用组，合用组中Rapa(nmol/L)和2-DG(mmol/L)的工作浓度组合为20+0.2、50+0.5、80+0.8、100+1，固定Rapa和2-DG浓度比例为100∶1。对照组加入用RPMI1640培养液稀释的DMSO，DMSO终浓度与单药处理组相同。空白组只加入200 µL RPMI1640培养液。每组设置3个复孔，置于细胞孵箱中孵育。48 h后各个处理组每孔均加入20 µL CCK-8工作液，37℃细胞孵箱孵育2 h，酶标仪450 nm测定每孔吸光度值，并计算单药及联用组的抑制率，抑制率=[(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔)] × 100%。

4 细胞周期分析 根据两药合用的最低合用指数 (combination index，CI)(协同作用最佳)，我们选取单药 Rapa(50 nmol/L)、2-DG(0.5 mmol/L)及两药联用 (0.5 mmol/L 2-DG + 50 nmol/L Rapa)作为后续实验的作用浓度。处理48 h后，离心(1 000 r/min)去上清，1.5 mL PBS 重悬并洗涤细胞两遍，逐滴加入1 mL预冷的75%乙醇，4℃固定过夜，离心 (1 000 r/min)弃乙醇，1 mL PBS 洗涤一遍，加入 500 µL PI/RNase 染色缓冲液，混匀后避光孵育20 min，上机检测。

5 细胞凋亡检测 MM 细胞经 Rapa(50 nmol/L)、2-DG (0.5 mmol/L)或联合处理 48 h 后，收集各组细胞，细胞离心 (1 000 r/min)去上清，1.5 mL PBS 重悬并洗涤细胞两遍，加入 500 µL 的 1 × 结合缓冲液重悬细胞，加入 Annexin V/FITC 5 µL，再加入 PI 15 µL，室温黑暗中孵育 15 min，使用流式细胞仪进行检测。Annexin V/FITC1阳性和PI阴性的细胞被认为是早期凋亡细胞，Annexin V/FITC1和PI阳性则被认为与晚期凋亡或坏死有关。6 Western blot检测蛋白表达 各组细胞用 RIPA裂解液在冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度，用裂解液稀释各组蛋白至相同浓度，与2×上样缓冲液1∶1混合，每组取30 µg 蛋白，经12% SDS-PAGE电泳(压缩胶 80 V，分离胶 120 V)，转移到PVDF膜上 (湿转法，恒流 220 mA，35 min)。5% 的脱脂奶粉室温封闭 1 h后，加入P53、Bcl-2、Bax、CyclinD1、GAPDH一抗(除GAPDH稀释比例为1∶10 000，其他一抗稀释比例均为 1∶1 000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入对应种属辣根过氧化物酶结合的二抗(稀释比例1∶4 000)，室温孵育1 h，增强型化学发光法(Millipore)检测目的蛋白条带。

7 计算药物合用指数 使用 CompuSyn 软件，按照Chou-Talalay方法计算合用指数。两种药物的联合作用可以总结为CI＜1、CI=1、CI＞1分别表示协同作用、相加作用、拮抗作用[13]。

8 统计分析方法 GraphPad Prism 8.0 软件 (San Diego，CA)用于数据处理、分析。使用SPSS22.0统计分析软件进行单因素方差分析。本研究的每个实验均进行3次重复，计量资料以±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 2-DG 增强了 Rapa 对 RPMI8226 细胞的毒性单 药 Rapa(10 nmol/L、 20 nmol/L、 50 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L)、单药 2-DG(0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L)以及 Rapa(nmol/L)与2-DG(mmol/L)固定比例合用(20+0.2、50+0.5、80+0.8、100+1)处理48 h后，如图1A和图1B所示，与对照组相比，Rapa或2-DG单独作用均显著抑制RPMI8226细胞的活力，且呈浓度依赖性。如图1C所示，当RPMI8226细胞经Rapa(nmol/L)和2-DG(mmol/L)以恒定比例(100∶1)共同作用时，与Rapa或2-DG单独作用相比，Rapa和2-DG联合作用对多发性骨髓瘤细胞株的生长有更强的抑制作用(P＜0.05)。

图1 Rapa和2-DG处理48 h对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的影响(aP＜0.05, vs对照组；bP＜0.05, vs雷帕霉素单药组；cP＜0.05, vs 2-DG单药组)Fig.1 Effect of rapamycin and 2-DG on the growth in RPMI8226 cells after 48 h treatment (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group; cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

2 CompuSyn 软件分析计算不同浓度 Rapa与 2-DG合用对RPMI8226细胞的CI值 利用CompuSyn软件分析计算Rapa与2-DG合用的CI值及相关合用指标，绘制不同浓度Rapa和2-DG作用于RPMI8226细胞的Fa-CI图，图2和表1显示了本研究中所用两药组合的协同效应结果，四个组合中 50 nmol/L Rapa + 0.5 mmol/L 2-DG 的 CI 值最小，协同效应最强。

表1 雷帕霉素和2-DG的合用指数Tab.1 Combination index for combination of Rapamycin and 2-DG

图2 CompuSyn软件合成雷帕霉素和2-DG合用的Fa-CI图，每一个圆形的点表示一个药物组合具体的合用指数值Fig.2 Fa–CI plots were calculated based on the Chou –Talalay equation using CompuSyn software version 1.0.Each round symbol designated the CI (combination index) values for each Fa (fraction affected) at four different dose points lines

3 Rapa 联合 2-DG 对 RPMI8226 细胞周期的影响图3A和图3B所示，Rapa(50 nmol/L)或2-DG(0.5 mmol/L)单药作用 48 h 降低了 RPMI8226 细胞S期的比例，细胞周期阻滞在G0/G1期，与Rapa单独作用相比，Rapa(50 nmol/L)联合2-DG(0.5 mmol/L)作用48 h明显增强了这一趋势。Rapa与2-DG合用进一步降低了RPMI8226细胞DNA合成期(S期)的比例，使细胞周期明显阻滞在G0/G1 期 (P＜0.05)。

图3 Rapa和2-DG对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226周期的影响(aP＜0.05, vs对照组；bP＜0.05, vs雷帕霉素单药组；cP＜0.05, vs 2-DG单药组)Fig.3 Effect of rapamycin and 2-DG on cell distribution in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group;cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

4 Rapa 联合 2-DG 对 RPMI8226 细胞凋亡的影响图4A和图4B所示，单药Rapa(50 nmol/L)作用于RPMI8226 48 h后，引起细胞轻度凋亡(约10%凋亡率)，而 2-DG (0.5 mmol/L)在 48 h 后未能诱导MM 细胞凋亡。Rapa(50 nmol/L)联合2-DG(0.5 mmol/L)作用 48 h 后，RPMI8226 的细胞凋亡率(约20%)显著高于Rapa单药组(P＜0.05)。

图4 Rapa和2-DG对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡的影响(aP＜0.05, vs对照组；bP＜0.05, vs雷帕霉素单药组；cP＜0.05, vs 2-DG单药组)Fig.4 Effect of rapamycin and 2-DG on apoptosis in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group;cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

5 Rapa 联合 2-DG 使 RPMI8226 细胞周期调控蛋白CyclinD1表达降低，促凋亡蛋白Bax和P53表达增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达降低 Westernblot结果显示 Rapa(50 nmol/L)和 2-DG(0.5 mmol/L)单药作用48 h，细胞周期调控蛋白CyclinD1表达水平较对照组降低，Rapa(50 nmol/L)和2-DG(0.5 mmol/L)合用 48 h，CyclinD1 的表达水平进一步降低。Rapa(50 nmol/L)和 2-DG(0.5 mmol/L)单药作用48 h增加Bax和P53的表达，降低Bcl-2的表达，与对照组和单药组比较，合用组进一步增加Bax和P53的表达，Bcl-2的表达更低(P＜0.05)，见图5。在蛋白水平显示出合用Rapa和2-DG对RPMI8226细胞具有明确的周期阻滞和增强凋亡的药理学作用。

图5 Rapa和2-DG对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226周期和凋亡相关蛋白表达的影响(aP＜0.05, vs对照组；bP＜0.05, vs雷帕霉素单药组；cP＜0.05, vs 2-DG单药组)Fig.5 Effect of rapamycin and 2-DG on cell cycle and apoptosis related protein in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group; cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

讨 论

代谢重编程是癌细胞的特征，表现出对有氧糖酵解的依赖。癌细胞有氧糖酵解的特征是葡萄糖消耗的增加和乳酸生成速率的提高，这一现象最早由Warburg在20世纪20年代描述，此后被称为Warburg效应[4]。在肿瘤研究中，葡萄糖代谢是肿瘤代谢研究最多的一个分支。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，用于调节蛋白质合成和细胞生长[14-15]。PI3K/AKT/mTOR通路参与肿瘤细胞代谢的调节，其中mTOR是Warburg效应的中心调控因子，也可以作为癌基因和肿瘤抑制基因的下游效应分子[7]。靶向mTOR通路的化合物在癌症治疗方面具有一定的应用潜力[16]。然而单用mTORC1抑制剂时，肿瘤细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路中从mTOR到AKT存在一个反馈机制，mTORC1被抑制能导致ATK活化，AKT活化导致该信号通路对mTOR抑制剂的抵抗和耐药。在骨髓瘤细胞中，mTORC1抑制剂Rapamycin抑制mTOR信号通路，会导致AKT的磷酸化水平升高并激活，同时抑制AKT和mTORC1才能产生协同的抗骨髓瘤作用[11]。抑制糖酵解活性在癌症治疗中一直是有吸引力的研究方向[17]，但至今使用糖酵解抑制剂的临床试验并没有取得成功。2-DG单药治疗在人异种移植动物肿瘤模型中无效，与化疗方法联合仅能轻度减慢肿瘤的生长。这是因为2-DG抑制糖酵解的关键酶-己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)后，肿瘤细胞通过磷酸戊糖旁路途径绕过HK2催化的下游糖酵解步骤继续为糖酵解提供代谢底物，而该旁路代谢过程依赖mTORC1[12]。这提示我们mTORC1抑制剂可以协同2-DG，发挥更强的抗肿瘤活性。Zhao等[18]发现mTORC1抑制剂Rapa与糖酵解抑制剂2-DG联合主要通过糖酵解途径对肝癌细胞具有协同抗肿瘤作用。Jiang等[19]报道mTOR复合物1/2抑制剂与糖酵解抑制剂对非小细胞肺癌细胞具有协同抑制作用，表现为细胞凋亡增加、葡萄糖摄取降低。张雪燕等[20]证实2-DG通过抑制己糖激酶的活性、抵抗阿霉素诱发的mTOR活化，降低糖酵解活性，增强白血病多药耐药细胞K562/ADM对化疗药的敏感性。高琪等[21]研究发现2-DG抑制糖酵解，同时下调缺氧诱导因子1α的表达，从而下调相关基因的表达改善肿瘤微环境，可增强抗血管生成药的抗肿瘤作用。

Rapa对不同类型的肿瘤细胞均有细胞周期阻滞作用。在我们的实验中，CCK-8结果提示Rapa和2-DG均能抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，呈浓度依赖性，当两药合用时显示出比单药更强的抑制作用，CI值均＜1，说明具有协同作用。细胞周期分析显示Rapa和2-DG合用组使MM细胞更多地阻滞在G0/G1期，S期比例显著下降，说明两药合用能发挥更大的细胞周期阻滞作用。当Rapa(50 nmol/L)单独作用MM细胞48 h时，发生了少量的凋亡，与2-DG(0.5 mmol/L)联合作用时，细胞凋亡率显著增加，表明促进骨髓瘤细胞凋亡也是合用组发挥协同作用的重要途径。Western blot也从蛋白水平揭示了合用组细胞周期调控蛋白CyclinD1的表达较单药组和空白对照组显著下调，合用组促凋亡蛋白P53、Bax的表达较单药组显著升高，而合用组凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达较单药组显著下降，我们猜想这些蛋白表达水平的变化与MM细胞糖酵解受到抑制有关。Vijay等[10]解释了Rapa对MM细胞的细胞毒性作用主要是通过自噬而不是凋亡来介导的。在本实验中，我们推测Rapa联合2-DG对MM细胞的细胞毒性作用部分是通过细胞自噬介导的，这一机制需要后续的实验进一步研究。

总之，我们证明了mTOR和糖酵解的双重抑制降低了多发性骨髓瘤细胞的增殖率和存活率，两药合用具有协同作用。我们从细胞周期阻滞、凋亡增加等机制解释了这一现象。这种组合将是治疗MM的一种有前景的方法，并为后续进一步研究其机制，尤其是致癌信号与肿瘤细胞代谢之间的相互作用提供了初步的基础。这些观察结果需要在临床前试验中进一步确认。