miR-301a对小鼠坏死性小肠结肠炎的影响及作用机制

邹大军，胡福德，周启立，徐晓青

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是导致新生儿死亡的重要原因，而幸存的婴儿也常出现严重的后遗症，包括短肠综合征、胆汁淤积和神经发育受损［1］。NEC的病理生理机制仍不完全清楚。研究表明，在溃疡性结肠炎的组织标本中发现了差异表达的miRNAs［2］。miRNAs在消化系统疾病中扮演关键角色［3］。miR-301a作为重要的miRNA已被视为结肠癌、胃癌的生物活性标志物［4-5］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。因此，本研究通过检测miR-301a及相关炎性因子在小鼠NEC中的表达水平，探索miR-301a在NEC疾病进展中的可能作用及机制，为NEC的临床研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级10日龄BALB/c小鼠60只，体质量4.2～8.0 g，平均（6.0±1.3）g，购自承德医学院动物研究中心（动物生产许可证号：SYXK冀2017-001），饲养在湿度45%～65%，温度28～30℃的环境中。miR-301a拮抗剂（序列：mGmCmUmUmUmGmAmCmAmAmUmAmCmUmAmUmUmGm CmAmCmUmG）购自中国武汉金凯瑞生物工程有限公司。肿瘤坏死因子（TNF）-α（货号：ml059766）、白细胞介素（IL）-6（货号：ml63159）和IL-8（货号：ml058632）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购自上海酶联生物技术有限公司。兔抗人胱天蛋白酶（Caspase）-1抗体（货号：22915-1-AP）购自美国Proteintech Group；兔抗人β-actin抗体（货号：AC038）购自武汉ABclonal公司。Esbilac幼犬配方奶粉购自美国PetAg公司。QT-MIX-3型缺氧箱购自长沙长锦科技有限公司。Trizol试剂（货号：15596026）购自赛默飞公司。反转录试剂盒（货号：1708890）、SYBR Premix Ex TaqⅡ系统（货号：1725124）、Image Lab 3.0软件均购自伯乐公司。HE染色试剂盒（货号：B0001 B0002）购自武汉博尔夫生物科技有限公司。细胞凋亡试剂盒（货号：11684817910）购自罗氏公司。RIPA缓冲液（货号：BL504A）购自北京兰杰柯科技有限公司。

1.2 实验动物分组 60只小鼠采用随机数字表法分为对照组、NEC组、miR-301a拮抗剂组，每组20只。对照组小鼠与母鼠同笼，由母鼠喂养；NEC组和miR-301a拮抗剂组采用Esbilac幼犬配方奶粉每天经口插管喂养4次，起始喂食量为0.1 mL，逐渐增加至0.25 mL。每天早晚2次喂养后将小鼠放入缺氧箱（5%O2、95%N2）持续10 min，随即打开缺氧箱，将其置入冰箱冷藏，给予4℃刺激持续10 min，连续5 d，诱导NEC［6］。miR-301a拮抗剂组诱导NEC的同时给予miR-301a拮抗剂（20μL/d）喂养5 d。

1.3 取材 实验期间每日观察小鼠的一般情况，测体质量。最后1次冷刺激后12 h，小鼠在麻醉下心脏采血，分离保存血清，取出十二指肠下段至直肠上段肠组织，保存一半新鲜组织，一半组织甲醛固定，石蜡包埋。

1.4 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测miR-301a和Caspase-1 mRNA表达 使用Trizol试剂从小肠组织中分离出总RNA。使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ系统行PCR。miR-301a引物：上游5′-ACACTCCAGCTGGGGCTCTGACTTTATTGC-3′，下 游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTAGT-3′；Caspase-1引物：上游5′-ATGGCCGACAAGGTCCTGAGG-3′，下游5′-GACATGATCGCACAGGTCTCGTG-3′；U6引物：上 游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反应条件：94℃2 min；94℃5 s，60℃30 s，40个循环。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.5 HE染色和损伤评分 将上述石蜡包块进行连续5μm切片，用二甲苯脱蜡、梯度乙醇至脱水后，进行HE染色，光镜下观察组织切片的病理改变。采用双盲法对肠道组织进行损伤评分，标准如下：0分，肠壁结构正常，上皮完整；1分，轻度的黏膜下和（或）固有层分离；2分，轻度的黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌肉层水肿；3分，重度黏膜下和（或）固有层肿胀分离，黏膜下和（或）肌肉层水肿，局部绒毛脱落；4分，肠绒毛消失伴肠坏死。

1.6 ELISA检测血清TNF-α、IL-6和IL-8的含量 使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量。通过分光光度法测定450 nm处吸光度（A）。根据标准曲线计算含量。

1.7 TUNEL染色测定小鼠肠组织的细胞凋亡情况 组织切片，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，每张切片选择5个染色典型的不重叠的高倍视野，计数凋亡的细胞数和细胞总数，计算凋亡细胞百分比。

1.8 Western blot检测Caspase-1蛋白表达水平 将获取的肠道组织溶解在RIPA缓冲液中，并以14 000 r/min离心10 min。离心后，用BCA测定总蛋白质浓度。在12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质，并转移至聚氟乙烯膜上，将膜与Caspase-1（1∶1 250）和β-actin（1∶500）一抗在4℃冰箱孵育过夜。在TBST中洗膜后，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，漂洗后ECL显影。最后用Image Lab 3.0软件进行定量分析。

1.9 统计学方法 采用SPSS 25.0进行数据处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较行单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法；计数资料以例（%）表示，组间比较行Z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学改变表现及体质量 入组实验时3组小鼠体质量差异无统计学意义。对照组小鼠每天进食正常，体质量稳定增长，结束时体质量增长最明显；NEC组小鼠从第2天开始相继出现精神萎靡、腹胀、进食障碍，体质量较实验前明显减轻，并出现血便。与NEC组相比，miR-301a拮抗剂组小鼠上述表现出现较晚，且症状较轻，体质量下降趋势变缓，见图1。

2.2 各组肠组织病理形态变化及损伤评分 HE病理染色结果显示对照组小鼠肠组织结构正常，肠道绒毛及上皮完整；NEC组小鼠肠壁全层大量炎性细胞浸润，黏膜层、黏膜下层及固有层可见明显的分离水肿，绒毛变性水肿，部分坏死；miR-301a拮抗剂组小鼠肠黏膜下和固有层肿胀分离程度及肌层水肿程度减轻，绒毛脱落情况及坏死也减轻，见图2。与对照组（0.7±0.3）相比，NEC组（3.4±0.7）小鼠肠组织损伤评分升高，而miR-301a拮抗剂组（1.2±0.5）小鼠肠组织损伤评分降低，差异有统计学意义（n=20，F=172.000，P＜0.01）。

2.3 各组小鼠血清中炎性因子表达水平比较 与对照组相比，NEC组小鼠中TNF-α、IL-6和IL-8含量升高（P＜0.05）；与NEC组相比，miR-301a拮抗剂组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8含量下降（P＜0.05），见图3A～C。

2.4 各组肠组织细胞凋亡水平 与对照组相比，NEC组肠组织凋亡指数显著升高（P＜0.01）；与NEC组相比，miR-301a拮抗剂组肠组织凋亡指数显著降低（P＜0.01），见图3D。

Fig.2 Variations of HE staining in 3 groups of mice(HE staining,×200)图2 3组小鼠肠组织病理改变（HE染色，×200）

Fig.3 Comparison of inflammatory factor expression and apoptosis level in intestinal tissue between three groups of mice图3 3组小鼠肠组织炎性因子表达及细胞凋亡水平比较

2.5 各组肠组织中miR-301a和Caspase-1的mRNA及蛋白表达水平比较 qPCR结果显示，与对照组相比，NEC组miR-301a和Caspase-1 mRNA表达水平明显升高，与NEC组相比，miR-301a拮抗剂组miR-301a和Caspase-1 mRNA表达水平显著下降（P＜0.01），见图4A、B。Western blot结果显示，与对照组比较，NEC组Caspase-1的蛋白水平明显升高，miR-301a拮抗剂组降低了上述指标的表达水平，见图4C。

Fig.4 Comparison of miR-301a and Caspase-1 protein expression levels in intestinal tissue between the three groups of mice图4 3组小鼠肠组织miR-301a和Caspase-1 mRNA及Caspase-1蛋白表达水平比较

3 讨论

NEC是新生儿胃肠道炎症死亡的重要原因。研究表明炎症级联反应是导致NEC发展的途径［7］，该炎症理论涉及到大量的炎性因子、受体和信号转导途径，它们通过激活肠道免疫反应系统，导致肠壁损伤和坏死［8］。在溃疡性结肠炎组织标本中发现了差异表达的miRNA，miRNA在炎症中的作用尤其重要，是介导炎症与组织修复的重要因素。研究表明，miRNA在能量代谢、免疫调节、内环境稳态、细胞凋亡、细胞增殖和分化中起重要作用，对这些功能的干扰会导致细胞凋亡和炎症的增加以及细胞修复能力的下降，这些在NEC的发病机制中至关重要［9］。miR-124通过靶向Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1（ROCK1）来抑制Toll样受体9（TLR9）的表达，进而促进肠道细胞凋亡和炎性细胞浸润，导致NEC的进展［10］。研究表明，miR-301a通过诱导炎症性肠病中的IL-17A和TNF-α来促进肠黏膜炎症［11］。然而，miR-301a在NEC中的作用尚不清楚。

多项研究已经证明，由miRNA介导的RNA通过各种干扰途径参与调节众多免疫过程，进而在肠道炎症中发挥重要作用［12］。Chen等［13］对NEC的细胞和动物模型的研究表明，miR-146a-5p的表达下调可以促进NEC中NLRP3炎性小体下游炎性因子和氯通道蛋白4（CLIC4）的表达，进而加重NEC的肠道炎症损伤。另有研究表明，在肠道炎症组织中高表达的miR-301a可以降低B细胞易位基因1（BTG1）的表达，从而降低上皮细胞的完整性，促进小鼠结肠的炎症以及刺激肿瘤的发生［14］。Caspase-1作为新兴的生物标志物在多种疾病中表达升高，同样也是NEC的常用监测因子，用于NEC的病情评估［15-16］。本研究表明，miR-301a在NEC小鼠的肠组织中高度表达，同时伴随Caspase-1的表达升高，使用miR-301a拮抗剂干预后，小鼠肠组织的病理炎症等级降低，Caspase-1的表达下降，这表明miR-301a在NEC的炎症进展中起了重要作用。

研究表明，对于NEC患儿，IL-8、IL-10和TNFα可用作早期诊断的生物标志物［17-19］。IL-8作为中性粒细胞和巨噬细胞的化学吸引剂，其肠道表达与NEC相关，IL-8可用作进行NEC术前风险评估的标记，手术前6 h内获得的IL-8水平与手术期间观察到的实际疾病严重程度呈正相关，而IL-8水平的升高与60 d死亡率有关［20］。本研究结果证实，NEC组肠组织miR-301a高表达，同时伴随TNF-α、IL-6和IL-8的表达增加以及细胞凋亡率升高，而给予miR-301a拮抗剂治疗后，炎性因子的表达均降低，细胞凋亡率下降，这表明miR-301a可能是NEC的潜在治疗靶点。

综上所述，miR-301a通过促进肠道组织细胞的凋亡而导致NEC的进展，而miR-301a可能是NEC的潜在治疗靶点和预后标志物。但由于NEC发病机制的复杂性，miR-301a促进细胞凋亡并导致NEC进展的具体机制仍需要进一步探索。此外，由于实验条件的限制，目前也仅在小鼠模型中观察到了miR-301a对于NEC的促进作用，而miR-301a增加TNF-α、IL-6、IL-8和细胞凋亡水平的具体机制仍有待进一步研究。