石蒜碱通过TLR4/NF-κB途径抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应

抗晶晶，曹翔，2△

神经炎症是神经系统疾病发生发展的关键因素，小胶质细胞作为脑内固有的免疫效应细胞，参与神经炎症过程［1-2］。静息态小胶质细胞能修复损伤、维持神经网络的正常功能；然而，微环境的变化会迅速活化小胶质细胞，过度活化的小胶质细胞主要转化为“促炎型”和“抑炎型”两种［3］。“促炎型”小胶质细胞分泌炎性因子加重脑损伤；而“抑炎型”小胶质细胞通过释放神经营养因子修复神经元-胶质细胞-血管单元。因此，抑制“促炎型”小胶质细胞异常激活及其介导的炎症反应被认为是治疗神经系统相关疾病的关键。石蒜碱（Lycorine，LYC）是植物石蒜的主要活性成分，因其具有多种生物学效应而受到广泛关注［4-6］。本课题组前期研究发现，LYC能够显著抑制脂多糖（LPS）诱导的外周巨噬细胞炎症反应［7］。有研究证明LYC可降低大鼠脑卒中梗死体积并改善神经功能缺损，但具体机制不清［8］。有关LYC对神经炎症，尤其是小胶质细胞表型转换以及炎症反应影响的研究较少。本研究旨在观察LYC对LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应和表型变化的作用，并对其机制进行探讨，为神经炎症性疾病的治疗提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1 材料 1～2日龄健康的SPF级C57BL/6新生小鼠60只，性别不限，体质量1.0～1.5 g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司［生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008］。LYC（纯度≥95%，CAS号2188-68-3）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。LPS购自美国Sigma公司；CCK-8、一氧化氮（NO）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗小鼠Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-κB p65亚基（NF-κB p65）、p-NF-κB p65、GAPDH抗体以及山羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling公司；CD11b（M1/70）、CD86（GL1）、CD206（MR6F3）及其同型对照流式抗体购自美国eBioscience公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及荧光定量试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细胞裂解液和蛋白酶抑制剂购自江苏凯基技术股份有限公司。倒置显微镜（型号：IX73）购自日本奥林巴斯公司；酶标仪（型号：SPARK）购自瑞士Tecan公司；荧光定量PCR仪（型号：StepOnePlus）购自美国ABI公司；凝胶成像仪（型号：1600）购自上海天能公司；流式细胞仪（型号：C6）购自美国BD公司。

1.2 原代小胶质细胞培养 取小鼠大脑皮层，加入胰蛋白酶消化10 min后吸去胰蛋白酶终止消化。将脑组织反复轻柔吹打成细胞悬液，经70μm滤器过滤后离心收集细胞，将细胞种于75 cm2培养瓶并放于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。培养2 d后待细胞贴壁，全部换液，继续培养到第7天时再次全部换液。每天观察细胞形态，第10天利用恒温摇床，250 r/min，15 min，收集含有原代小胶质细胞的上清液进行后续实验。将细胞分为对照组、LYC组、LPS组和LPS+LYC组。对照组细胞不做处理；LYC组细胞使用0.1、0.5、1和5μmol/L LYC处理24 h；LPS组细胞使用0.1 mg/L LPS处理24 h；LPS+LYC组细胞使用5μmol/L LYC预处理1 h后加入0.1 mg/L LPS再处理24 h。利用倒置显微镜观察细胞形态并拍照记录。

1.3 流式细胞术检测小胶质细胞纯度及LPS诱导原代小胶质细胞向两种表型转化情况 收集对照组、LYC组、LPS组以及LPS+LYC组的原代小胶质细胞，加入表面流式抗体（CD11b、CD86和CD206）或相应的同型对照抗体，涡旋混匀后于室温下避光孵育15 min，PBS洗涤细胞后300 r/min离心15 min，弃去上清液加入200μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上进行检测，结果采用FlowJo V10流式软件分析。

1.4 细胞活性检测 将对照组与LYC组细胞以5×104的密度均匀接种在96孔板中。培养24 h后弃旧培养基，再加入含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基，于37℃孵育2 h后置于酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。

1.5 实时荧光定量PCR（qPCR）检测炎性因子和不同表型小胶质细胞表面标志物mRNA表达 按RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA并进行逆转录，之后在荧光定量PCR仪器上进行PCR扩增，白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等引物序列见表1，以GAPDH为内参。20μL反应体系包括2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA（50μg/L）2.0μL，灭菌水7.2μL。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃30 s，共40个循环。每组设3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

Tab.1 The sequences of the primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6 NO检测 收集各组的细胞上清液，利用经典的Griess法测定NO含量。

1.7 免疫印迹法检测TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达 将各组细胞用预冷PBS润洗3遍后，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂后在冰上裂解30 min，4℃12 500 r/min离心30 min收集上清蛋白。BCA法测定并计算蛋白浓度后取等量蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将分离的蛋白采用湿转法转移到PVDF膜上，之后置于5%的脱脂奶粉中封闭1 h。一抗TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65（均为1∶1 000稀释）、GAPDH（1∶5 000）于4℃冰箱孵育过夜，次日回收一抗，PVDF膜再与山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，化学发光法于凝胶成像仪器中显影，利用Image J软件分析结果。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析。数据采用±s表示。2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LYC对原代小胶质细胞活性的影响 流式细胞术结果示CD11b阳性的原代小胶质细胞占总细胞的95%以上，见图1，满足实验要求。对照组，0.1、0.5、1和5μmol/L LYC组细胞活性分别为1.000±0.037、1.023±0.024、1.064±0.121、0.960±0.022和1.026±0.038，差异无统计学意义（n=4，F=1.598，P＞0.05）。为研究LYC的最大有效剂量，后续研究均以5μmol/L的LYC为药物浓度。LYC组小胶质细胞的形态并未改变，但是LPS组小胶质细胞突起缩短变厚，胞体增大，呈现阿米巴样，LPS+LYC组阿米巴样小胶质细胞数量明显减少，见图2。

Fig.1 Purity verification of primary microglia cells图1 原代小胶质细胞纯度验证

2.2 LYC对原代小胶质细胞炎性因子mRNA表达水平及NO含量的影响 与对照组相比，LPS组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平以及NO含量的表达升高（P＜0.01）；与LPS组比较，LPS+LYC组以上炎性细胞因子表达水平和NO含量降低（P＜0.01），见表2。

2.3 LYC对小胶质细胞CD86、CD206 mRNA和表型比例的影响 与对照组相比，LPS组CD86和CD206 mRNA表达水平和表型比例升高（P＜0.01）；与LPS组比较，LPS+LYC组CD86 mRNA表达水平和表型比例降低，CD206 mRNA表达水平和表型比例升高（P＜0.01）。见表3，图3。

Fig.2 Effects of LYC on the morphology of primary microglia cells(×200)图2 LYC对原代小胶质细胞形态的影响（×200）

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA expression level and NO content between the four groups表2各组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及NO含量比较 （n=4，μmol/L，±s）

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-αmRNA expression level and NO content between the four groups表2各组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及NO含量比较 （n=4，μmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与LPS组比较，P＜0.01；表3、4同。

组别对照组LYC组LPS组LPS+LYC组F IL-1βmRNA 1.026±0.137 1.135±0.507 1 357.000±186.300a 631.900±83.950ab 159.500＊＊IL-6 mRNA 1.047±0.118 1.032±0.156 3 644.000±391.400a 1 549.000±267.200ab 212.000＊＊组别对照组LYC组LPS组LPS+LYC组F TNF-αmRNA 1.036±0.128 1.136±0.508 397.700±62.410a 248.800±45.230ab 103.100＊＊NO含量1.185±0.366 2.238±0.949 28.770±2.472a 18.830±4.847ab 93.640＊＊

Tab.3 Comparison of CD86 and CD206 mRNA expressionlevels and phenotypic ratio between the four groups表3各组CD86和CD206 mRNA表达水平和表型比例比较 （n=4，±s）

Tab.3 Comparison of CD86 and CD206 mRNA expressionlevels and phenotypic ratio between the four groups表3各组CD86和CD206 mRNA表达水平和表型比例比较 （n=4，±s）

组别对照组LYC组LPS组LPS+LYC组F CD86 mRNA 0.921±0.062 0.741±0.207 6.003±1.094a 3.427±0.542ab 63.910＊＊CD206 mRNA 1.190±0.419 0.972±0.278 3.682±0.584a 6.200±0.695ab 89.730＊＊CD86（%）9.150±0.387 9.020±0.486 36.150±2.525a 22.400±2.754ab 186.600＊＊CD206（%）8.463±0.697 8.850±0.265 16.680±1.396a 25.150±1.234ab 246.500＊＊

Fig.3 The flow cytometry results of LYC on different phenotypic primary microglia cells induced by LPS图3 LYC对LPS诱导的原代小胶质细胞不同表型的流式图

2.4 LYC对LPS诱导的原代小胶质细胞TLR4/NFκB信号通路的影响 与对照组相比，LPS组TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与LPS组比较，LPS+LYC组TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平降低（P＜0.01），见图4，表4。

Fig.4 Effects of LYC on TLR4/NF-κB signaling pathway in LPS-induced primary microglia cells图4 LYC对LPS诱导的原代小胶质细TLR4/NF-κB信号通路的影响

3 讨论

小胶质细胞介导的神经炎症已被证实是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森及脑卒中预后的重要因素。研究表明，活化的小胶质细胞释放的炎症介质能促进β-淀粉样蛋白（Aβ）产生和积累［9］。帕金森死亡患者脑组织中可以检测到小胶质细胞的异常激活以及相关的炎性细胞因子释放［10］。过度激活的小胶质细胞在脑卒中早期和晚期的继发性损伤中起到关键作用，加重脑损伤［11-12］。因此，干预小胶质细胞介导的炎症反应是治疗以上神经系统疾病的有效方法。

Tab.4 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels between the four groups表4 各组TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达水平比较（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway protein expression levels between the four groups表4 各组TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达水平比较（n=3，±s）

组别对照组LYC组LPS组LPS+LYC组F TLR4 0.992±0.153 1.391±0.180 2.547±0.016a 1.665±0.207ab 52.930＊＊p-NF-κB p65 1.000±0.064 1.139±0.063 2.214±0.242a 1.246±0.384b 17.070＊＊

石蒜是一味中草药，主要生长在我国长江以南地区。LYC是石蒜提取物中最主要的活性物质，本质上是一种吡咯并菲啶的环形生物碱。研究发现，LYC能抑制肿瘤细胞转移和细胞周期进程，促进肿瘤细胞凋亡［4，13］。近年有研究表明，LYC能剂量依赖性地抑制感染细胞中新型冠状病毒的复制［14］。炎症方面，LYC被证实能够减少LPS诱导的骨丢失［15］。同时，笔者之前的研究发现LYC具有改善外周巨噬细胞炎症反应的能力［7］。然而关于LYC对小胶质细胞介导的炎症反应的作用甚少。本研究的结果显示，LPS刺激可促使小胶质细胞向阿米巴样转变，增加了炎性细胞因子的表达以及“促炎型”小胶质细胞的比例，而LYC可以改善原代小胶质细胞的形态，抑制炎性细胞因子表达，并提高“抑炎型”小胶质细胞的比例。这些结果提示LYC具有拮抗LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的能力，且与其促进小胶质细胞由“促炎型”向“抑炎型”的转化有关。

目前，大量研究表明多个信号通路在小胶质细胞表型转化中发挥作用。Li等［16］发现环状RNAPrkcsh通过JNK/p38 MAPK通路促进小胶质细胞向“脊髓损伤”型极化。有关系统性红斑狼疮的研究发现，丙酮酸激酶通过β-catenin信号通路促进小胶质细胞向“吞噬型”转化，破坏认知功能［17］。TLR4/NFκB是目前被研究较多且明确与小胶质细胞表型转化有关的通路。TLR4作为LPS的受体，其在脑内大量表达于小胶质细胞［18］。TLR4被激活后在细胞质内形成复合体，继而通过磷酸化NF-κB将信号传递到细胞核内。磷酸化的NF-κB启动细胞核中下游相关基因的转录，生成相应的mRNA，合成炎性因子和控制小胶质细胞表型转化的蛋白，引起一系列炎症反应［19］。本研究结果显示，LPS刺激增加了TLR4的表达和NF-κB p65的磷酸化水平，而LYC可以逆转这一现象，提示LYC可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制小胶质细胞向“促炎型”转化，进而降低促炎细胞因子的表达，减轻炎症反应。

综上所述，LYC能减轻LPS所致的小胶质细胞炎症反应，可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来实现的。本研究为开发LYC作为一种新的神经系统疾病保护药物提供了实验依据。