奶粉中胆固醇的测定方法验证

崔承远

北大荒完达山乳业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150078

0 引言

胆固醇，别称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，其广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量较高，其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚等溶剂，是动物组织、细胞所不可缺少的重要物质。

胆固醇在人体内有着广泛的生理作用，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症、高胆固醇血症有密切的相关性。如果是单纯的胆固醇高，则饮食调节是最好的办法；若还伴有高血压等症状，则需要同时使用降压药物。因此，胆固醇虽然不是婴幼儿配方奶粉及成人奶粉中的必检项目，但对于其含量却同样需要进行相应的监测。

本检测方法相比于目前检测食品中胆固醇所常用的方法——《GB5009.128—2016食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》中第一法气相色谱法而言，具有操作更便捷，耗时相对更短等优势，可以在一定程度上提高实验室工作效率。

1 材料与方法

1.1 试剂

无水乙醇（C2H6O），体积分数为95%，分析纯；正己烷（C6H14），色谱纯；石油醚，沸程30～60 ℃，分析纯，氢氧化钾（NaOH），分析纯；无水硫酸钠（Na2SO4），分析纯；胆固醇标准物质，纯度＞99%。

1.2 溶液配制

氢氧化钾溶液（666.7 g/L）：称取氢氧化钾200 g于500 mL烧杯中，用无水乙醇定容。

胆固醇标准物质储备液（1.0mg/mL）：称取胆固醇标准物质100 mg（精确至0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用正己烷定容，混匀。此为浓度为1.0 mg/mL的胆固醇标准物质储备液。

胆固醇标准物质中间液（0.010mg/mL）：准确移取1.0 mL胆固醇标准物质储备液于100 mL容量瓶内，用正己烷定容，混匀。此为浓度为0.010 mg/mL的胆固醇标准物质中间液。

1.3 仪器设备及参数

1.3.1 仪器设备

气相色谱仪（配置有FID氢火焰离子化检测器），美国珀金埃尔默公司；电子天平（感量为0.1mg），山东博科科学仪器有限公司；平行浓缩仪，睿科集团股份有限公司；超声波振荡仪，昆山洁力美超声仪器有限公司；恒温磁力搅拌器，唐山力辰科技有限公司；分液漏斗（125 mL），天津天玻科技发展有限公司。

1.3.2 气相色谱仪参数设置

进样口温度：300 ℃；检测器温度：300 ℃；分流比：10:1；进样量：1.0 μL；色谱柱：型号DM-35石英毛细管柱，柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25μm；程序升温：如表1所示；辅助气体：氢气45 mL/min、空气450 mL/min；载气：高纯氮气1.0 mL/min。

表1 程序升温条件

2 分析步骤

2.1 试样处理

2.1.1 试样皂化

称取奶粉试样（不含淀粉）1 g（精确至0.0001 g）于38 mL具四氟乙烯螺纹帽玻璃试管中，先后加入5 mL95%乙醇溶液及10 mL氢氧化钾溶液，拧紧瓶盖，将试管置于恒温磁力搅拌器内以（100±5）℃水浴皂化反应1 h[1]。

2.1.2 组分提取

水浴结束后将样液冷却至室温，以少量水将试管内样液转移至125 mL分液漏斗内，加入25 mL石油醚萃取2～3 min[2]。将下层水相转移至另一只125 mL分液漏斗中，加入25 mL石油醚再次萃取2～3 min。合并两次提取液，以超纯水冲洗提取液直至呈现中性[3]。

2.1.3 浓缩定容

将提取液通过无水硫酸钠过滤至250 mL鸡心瓶内，并以石油醚冲洗分液漏斗及过滤漏斗，将冲洗液与提取液合并，置于旋转蒸发仪内蒸发浓缩至近干。用正己烷将鸡心瓶内样液转移至10 mL容量瓶内，以正己烷定容，混匀[4]。此为胆固醇样液，气相色谱仪待测[5]。

2.2 标准曲线制作

分别吸取浓度为0.010 mg/mL的胆固醇标准物质中间液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL和50.0 mL于6 支10 mL容量瓶内，以正己烷定容，混匀，此为浓度分别为0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL及50 μg/mL的胆固醇系列标准物质工作液。

将稀释好的胆固醇标准系列工作液分别注入到气相色谱仪中，得到每个浓度的胆固醇标准物质工作液所对应的响应值（峰面积）和图谱。

以胆固醇响应值（峰面积）为纵坐标，胆固醇的质量为横坐标绘制胆固醇标准物质曲线，得到胆固醇回归方程。

2.3 试样溶液的测定

相同条件下，将样品溶液分别引入气相色谱仪进行测定。根据回归方程计算出样品中胆固醇的浓度。

2.4 分析结果的表述

试样中胆固醇含量按式（1）计算：

式中：X-试样中胆固醇的含量，单位为毫克每千克（mg/100g）；Cs-从标准曲线中得到试样测定胆固醇的质量含量，单位为毫克（mg）；m-试样的质量，单位为克（g）；fi-试样测定液稀释倍数；100-换算系数。计算结果保留至小数点后一位。

2.5 方法特性参数验证

2.5.1 线性范围

称取胆固醇标准物质0.1000 g，按照胆固醇标准物质溶液曲线方程制作的操作步骤进行操作。分别配制6 个浓度点，每个浓度点平行运行3 次，得到18 个浓度点所对应的响应值（峰面积）[6]。如表2所示。

表2 胆固醇标准物质工作液浓度及响应值（峰面积）对应表

应用上述18 个标准物质工作液所对应的响应值/峰面积及对应的碘质量拟合曲线方程，得到胆固醇标准物质曲线方程为：

胆固醇标准物质曲线图如图1所示。从试验结果可见，标准曲线线性回归方程相关系数大于0.99，浓度范围覆盖关注浓度的0%～150%。

图1 胆固醇标准物质曲线图

2.5.2 方法检出限与定量限

采用空白标准偏差法，选择脱脂奶粉样品，称取10 份，每份称取1 g，按照标准方法进行试样预处理，并对最终样液进行10 倍稀释，用于胆固醇方法检出限的测定。并通过气相色谱分析得出图谱及各自响应值（峰面积）。

参考《GB 5009.128—2016食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》中第一法气相色谱法中胆固醇的检出限0.3 mg/100 g，其对应的检出浓度为0.3 μg/mL。本方法按照该检出浓度，以脱脂奶粉作为空白本底试样，加入适量胆固醇标准物质，使其最终理论浓度0.3 μg/mL。并按照上述2.1进行10 平行试验，10 次检测结果及方法检出限及定量限详见表3。

由表3得出，胆固醇的方法检测限（LOD）=0.08 mg/100 g，胆固醇的方法定量限（LOQ）=0.24 mg/100 g。

表3 胆固醇方法检出限与定量限结果 单位：mg/100g

2.5.3 精密度

选择成人奶粉样品，进行10 平行试验，按照上述所描述的操作步骤进行试样前处理和测定，并应用上述方法检出限所应用的标准物质线性方程进行批处理及计算[7]。试验结果详见表4。

表4 胆固醇精密度试验结果

2.5.4 正确度

选择脱脂奶粉样品作为本底试样，分别进行3 水平6 平行加标回收率试验，即正确度试验。3 水平加标浓度分别为低浓度、中浓度和高浓度，其中低浓度加标回收率试验按照上述试验所得方法检出限，即0.08 mg/100 g本底含量的0.5倍进行加标，中浓度加标回收率试验按照本底含量的1.0 倍进行加标，高低浓度加标回收率试验按照本底含量的1.5 倍进行加标[8]。试样处理过程按照《GB 5009.128—2016 食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》执行。加标含量及回收率详见表5。

表5 胆固醇正确度试验结果

经计算，胆固醇3 水平6 平行共计18 个加标回收率试验，结果在91.1%～110%之间。

3 结论

经线性范围、方法检出限、精密度和正确度方法特性参数的验证，得出胆固醇的方法检出限为0.08 mg/100 g，方法定量限为0.24 mg/100 g，精密度为2.03%，3 水平6 平行正确度试验加标回收率在91.1%～110%范围内，均满足《GB/T 27417—2017合格评定 化学分析方法确认和验证指南附录A》的要求。