7 味中药对奶牛乳房炎病原菌的体外抑菌试验研究

寨鸿瑞，张懂理，郭 庆

1 开封市动物疫病预防控制中心，河南开封 2667002 淮北市烈山区农业农村水利局，安徽淮北 2350003 安徽科宝生物工程有限公司，安徽淮北 235000

0 引言

奶牛乳房炎（Mastitis）是由病原微生物侵入、机械性刺激及化学物理性损伤所致的奶牛乳房实质、间质炎症的疾病，是奶牛常见疾病之一，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失，是制约奶业发展的主要疾病。其主要致病因素是传染性病原微生物，包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌等[1～3]。安徽省奶牛乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，所占比例为72.72%[4]。目前，主要用抗生素防治奶牛乳房炎，存在抗生素残留和耐药性等问题[5]，随着人民生活水平的日益提高，国家对乳制品质量有了更严格的标准，临床治疗奶牛乳房炎的抗生素逐步被限用或禁用[6]。中草药是纯天然物质，具有抗菌、消炎、无耐药性、无残留等特点，应用中草药替代抗生素防治奶牛乳房炎[7，8]，已日益成为奶牛场的共识。本试验采用试管二倍稀释法，比较7 味中药对3 种主要致病菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以筛选出效果好的中药，为研制治疗奶牛乳房炎方剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药

紫锥菊、金银花、连翘、紫苏、杜仲叶、黄芪、甘草均为生药，购于市养生堂大药房。

1.1.2 试验菌株

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌从安徽淮北某奶牛场患有隐性乳房炎奶牛的牛奶中分离。

1.1.3 仪器

HH-4数显恒温水浴锅、RE-52旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；DL-360B智能超声波，上海之信仪器有限公司；微量移液器，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；LD4-2低速离心机，上海沪粤明科学仪器有限公司；LDZX-50FBS立式电热压力蒸汽灭菌器，上海恒磁电子科技有限公司；H-B11-500型电热恒温培养箱，上海新诺仪器集团有限公司；SW-CJ-1F单人双面净化工作台，南京莱步科技实业有限公司。

1.1.4 试剂及培养基

食品级无水乙醇，安徽安特食品股份有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨，北京三药科技开发公司；普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、LB培养基，参照文献[9]制备。

1.1.5 中药液的制备

将紫锥菊、金银花、连翘、紫苏、杜仲叶、黄芪、甘草分别准确称取100 g，用75%乙醇浸泡30 min（料液比10∶1），然后超声15 min，第一次回流提取2 h，用16 层纱布过滤倒出药液。药渣再加75%乙醇（料液比8∶1），第二次回流提取1 h，倒出药液，合并两次滤液，旋转蒸发至无醇味至每毫升含1 g生药，3000 r/min离心10 min，取上清液，121 ℃流通蒸汽灭菌15 min。灭菌后4 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 操作步骤

采用试管二倍稀释法测定MIC，操作全部在超净工作台内进行。

（1）取加塞无菌小试管9 支，每管中加入制好的普通肉汤培养基1 mL，在第1管中加中药1 mL，用微量移液器混匀，吸取1 mL至第2管混匀，依次到第7管，第8管做阳性对照（加菌液不加中药），第9管做阴性对照（加中药不加菌液）。

（2）加稀释好的菌液0.1 mL，第9管不加菌液。此时1到7号管内药液的浓度分别相当于500.00 mg/mL、250.00 mg/mL、125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL生药浓度，8号管作阳性对照管，9号管作阴性对照管。

（3）将各组试管置37 ℃恒温培养箱中培养18 h，观察记录结果。与对照组比较，有絮状沉淀的管则为有细菌生长，无絮状沉淀的管为细菌生长受抑制管，以肉眼观察无絮状沉淀管的最低药物浓度作为该药MIC。

（4）重复1至3步，试验结果取3 次试验的平均值。

1.2.2 结果判断

由于中药对细菌的MIC国内目前尚无统一的标准，本试验参照同类试验[10]的标准作为判断标准。

当MIC＜7.81 mg/mL生药浓度时为高度敏感；当MIC在15.63～62.5 mg/mL生药浓度时为中度敏感；当MIC为62.5～250.00 mg/mL生药浓度时为较敏感；当MIC＞250.00 mg/mL生药浓度时为不敏感。见表1。

表1 不同中药浓度的药敏判断标准

MBC的判断：测出MIC后，再依次从未见细菌生长的各试管培养物中取一接种环，接种于不含药的普通琼脂平板上，轻轻摊开菌液，37 ℃培养24 h，观察有无细菌生长。在普通琼脂平板中，生长的菌落数小于5 个菌落的药液最低浓度，即为MBC。

2 结果

7 味中药对3 种致病菌的体外抑菌浓度MIC和MBC的测定结果见下表2。从表中可以看出金银花、紫锥菊、连翘、甘草、紫苏对金黄色葡萄球菌中度敏感，杜仲叶、黄芪次之；紫锥菊、紫苏、金银花对大肠杆菌中度敏感，连翘次之；金银花和连翘对无乳链球菌中度敏感，紫苏次之。

表2 7 味中药对3 种致病菌的MIC和MBC 单位：mg/mL

3 讨论

本试验所用菌株直接从患病奶牛乳中分离并鉴定，用中草药提取物对3 种细菌的抗菌活性进行测定。从本次试验结果可知，7 味中药对3 种细菌的MIC和MBC与文献报道[11～13]相一致。中药的不同产地，不同季节采收其所含成分不同，不同地方细菌分离菌株和毒力是影响中药体外抑菌试验结果的重要因素。

本试验采用75%乙醇回流提取法提取药液，回收乙醇并浓缩至每毫升含1 g生药测定其抑菌效果，金银花和甘草对金黄色葡萄球菌抑菌效果最强，MIC值均为15.63 mg/mL，MBC值均为31.25 mg/mL；紫锥菊对大肠杆菌的效果最强，MIC值为15.63 mg/mL，MBC值为31.25 mg/mL；金银花和连翘对无乳链球菌抑菌效果最强，MIC值均为31.25 mg/mL，MBC值均为62.5 mg/mL。从本次试验结果可知，紫锥菊、金银花、连翘可作为防治奶牛乳房炎制剂的主药，但与其他药物之间的配伍作用及其体外药理作用还需要进一步研究。