温度对紫外分光光度法测定生乳中亚硝酸盐含量的影响

杨美丰，纪坤发，何 瑛，利志锋，陈锦璇，杨爱君

广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 511356

0 引言

生乳中亚硝酸盐的含量，影响乳制品的质量安全。亚硝酸盐作为生态系统中氮循环的组成成分之一，广泛地存在于自然环境中[1]。生乳中亚硝酸盐含量超标问题，可由奶牛场的卫生不达标，或者水质、饲料成分等众多原因造成。而亚硝酸盐会使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因而失去携氧的能力而导致人体呼吸衰竭，甚至导致大脑缺氧。在胃酸环境下，亚硝酸盐可以与食物或胃中的仲胺、叔胺等发生反应，生成致癌物亚硝胺[2]，其在人体内聚集可引起食道癌、胃癌、大肠癌等[3，4]。根据《GB2762—2017 食品安全国家标准 食品中污染物限量》的要求[5]，生乳的亚硝酸盐含量不得高于0.4 mg/kg，因此，监控生乳中亚硝酸盐的含量至关重要。

目前，检测生乳中亚硝酸盐含量的方法有色谱法、分光光度法、电化学分析法和快速检测法[6]。我国国家标准《GB 5009.33—2016 食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》主要检测方法为离子色谱法和分光光度法[7]，但其中的分光光度法在液体乳前处理用的是“沸水浴”形式，并未指明其最适加热温度。加热温度过高会导致试样沉淀液中洗脱游离出来的亚硝酸根离子分解，而当加热温度达不到要求时，试样沉淀液中的亚硝酸根离子不能完全洗脱游离出来，以上两种情况都会导致试样的加标回收率偏低、重复性差。本研究通过改变其加热温度，以确定合适的加热温度，为企业日常检测生乳中亚硝酸盐含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 试剂

亚硝酸钠溶液标准物质，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、盐酸，广州化学试剂厂；对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，国药集团化学试剂有限公司；乳粉质控样，北京美正检测技术有限公司。

生乳来自广东、福建、甘肃等地的奶牛场。本方法所用试剂均为分析纯。水为《GB/T 6682—2008分析试验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.1.2 仪器设备

紫外可见分光光度计，日本岛津公司；冷冻离心机，德国Sigma公司；电磁炉，九阳股份有限公司；振荡水浴箱，德国Julabo公司；电冰箱，德国西门子股份公司；超纯水系统，德国默克密理博公司；移液枪，德国普兰德公司；涡旋振荡器，广州海太光电生物科技有限公司；50 mL离心管。

1.1.3 溶液配制

亚铁氰化钾溶液（150 g/L）：称取15.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，稀释至100 mL。

乙酸锌溶液（220 g/L）：称取22.0 g乙酸锌，先加3 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100 mL。

饱和硼砂溶液（50 g/L）：称取25.0 g硼酸钠，溶于500 mL热水中，冷却后备用。

盐酸（20%）：量取20 mL盐酸，用水稀释至100 mL。

对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL20%盐酸中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：称取0.2 g盐酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混匀，置棕色瓶中，避光保存。

亚硝酸钠标准储备液（40 mg/L）：吸取10 mL亚硝酸钠溶液标准物质（浓度200 μg/mL）于50 mL容量瓶，用水稀释至刻度，混匀后置于4 ℃避光保存。

亚硝酸钠标准使用液（5 mg/L）：吸取3.125 mL亚硝酸钠标准储备液（40 mg/L）于25 mL容量瓶，用水稀释至刻度。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

吸取18 mL样品于50 mL离心管，加入2.5 mL饱和硼砂溶液，混匀，再加入70 ℃左右的水约12 mL，混匀，分别于93 ℃、95 ℃、97 ℃、99 ℃水中加热15 min，取出放于冷水中冷却，放置至室温后加入1 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入1 mL乙酸锌溶液，摇匀，以沉淀蛋白质，最后加5.5 mL水定容至40 mL。放置沉淀2 h后离心（9000 r/min，3 min），过滤，滤液备用。

1.2.2 标准曲线

吸取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.075 μg、0.15 μg、0.3 μg、0.45 μg、0.6 μg、0.75 μg、0.9 μg亚硝酸钠）于10 mL比色管，加入0.6 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置3～5 min，再加入0.3 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min后以零管调节零点上机测定。

1.2.3 样品测定

吸取4 mL样品于10 mL比色管，加入0.6 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置3～5 min，再加入0.3 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min后，用1 cm的比色管，于波长为538 nm处测吸光度，同时做试剂空白。

1.2.4 计算公式

X-试样中亚硝酸钠的含量，mg/L；C-曲线得出亚硝酸钠的浓度，mg/L；V0-试样处理液总体积，40 mL；10-测定用样液最终定容体积，mL；V1-取样量，18 mL；V2-测定用样液体积，4 mL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按照1.2.2的步骤进行试验，以亚硝酸钠浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，建立标准曲线。如图1所示，得到回归方程为y=0.76896x-0.00030，相关系数R2=0.99991，线性关系良好。

图1 亚硝酸钠标准曲线图

2.2 在不同温度下样品加标回收率试验

制备3 个不同浓度水平的加标奶样，每个浓度的加标样做2 个平行，检测的空白奶样作为对比，按照样品前处理方法进行检测，计算回收率，结果见表1。

由表1可知，随着水浴温度的上升，亚硝酸盐回收率上升，当温度增加到95 ℃时，回收率达到90.50%以上，此后，水浴温度继续上升，回收率反而是下降趋势。可见，水浴温度维持在95 ℃时，可以较好地满足试验要求。

表1 加标回收率试验

2.3 同一温度下重复性试验

随机选取奶牛场样品，在加热温度95 ℃下，按照上述方法进行处理，平行测定6 次，分别记录吸光度值，计算亚硝酸盐检测值，试验结果见表2。

表2 重复性试验（n=6）

由表2可知，在加热温度为95 ℃下，平行测定的6 个样品的RSD为2.04%，低于5%，表明该温度下亚硝酸盐测定结果的重现性良好。

2.4 乳粉质控样品验证试验

参照样品前处理方法对乳粉质控样品进行检测，验证方法的准确性，测得结果见表3。

表3 质控样品测定结果

由表3可知，加热温度在95 ℃的前处理方法下，亚硝酸盐的测定值在质控样品的标准值区间内，相对平均偏差0.02%，方法的准确性良好。

3 讨论

目前，检测生乳中亚硝酸盐含量的方法有色谱法、分光光度法、电化学分析法和快速检测法[6]。崔晓青等[8]建立的离子色谱法可以准确地检测乳制品中亚硝酸盐含量，该方法标准曲线线性（R=0.9957），方法回收率（80.5%～116.87%），RSD值（4.195%）；杜晓旭等[9]研究设计了可用于快速定性检测牛乳及乳制品中亚硝酸盐的方法，该方法可以根据试样的显色结果快速的定性；戴兴德等[10]设计研究了活化玻碳电极直接测定法检测牛奶中亚硝酸盐含量，该方法标准曲线线性（R=0.9994），方法回收率（97%～98%）。而本文建立的紫外分光光度法检测生乳中亚硝酸盐含量，其标准曲线线性（R2≥0.99991），方法回收率（90.50%～92.17%），RSD值（2.04%），均比上述方法有一定优势，具有操作简便、分析快速、测定结果准确、精密度好等优点，能够准确而又快速检测生乳中亚硝酸盐含量。

4 结论

本文通过研究温度对紫外分光光度法测定生乳中亚硝酸盐含量的影响可得，试验前处理加热温度设置在95 ℃，结果显示试验稳定性良好，3 个（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L）不同水平的加标平均回收率为91.00%、90.50%、92.17%，重复性试验RSD＜5%，满足检测质量的要求，该方法适合生乳中亚硝酸盐含量的检测。