EGFR罕见突变致奥希替尼耐药的晚期肺腺癌1例并文献复习

焦赵爽 张寒菲 郑大鹏 王萍★

在我国肺癌的发病率和死亡率仍居各类恶性肿瘤之首。晚期非小细胞肺癌（Non⁃small⁃cell Lung Cancer，NSCLC）患者中，表皮生长因子受体（Epi⁃dermal Growth Factor Receptor，EGFR）的突变率高，占40%～55%（其中约90%为19DEL 或L858R）［1］；与传统的化疗相比，酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine ki⁃nase inhibitor，TKI）介导的靶向治疗显著延长携带EGFR敏感突变的晚期NSCLC 患者的生存期，同时其生存率和生活质量也得到了极大的改善。EGFR⁃L858R 突变的晚期NSCLC 患者使用第一代EGFR⁃TKI 治疗后疾病进展，出现继发T790M 突变主要续贯口服第三代TKI 奥希替尼［2］，但仍不可避免地会产生获得性耐药。二线奥希替尼治疗后进展的耐药机制有多种，分EGFR依赖性和非依赖性，已知的主要包括EGFR修饰（突变/扩增），旁路途径激活，下游途径激活，上皮⁃间质转化（Epithelial⁃mesenchymal tran⁃sition，EMT），组织学转化，致癌基因融合等，因此再次活检、重复血液基因分子分型及基于二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）的检测平台是关键。目前，服用奥希替尼进展后最常见的耐药位点为C797S 突变（约占14%）［3］，也是研究者们关注的热点［4⁃7］，然而与C797S 位点相邻EGFR⁃G796S 突变却鲜有报道。本研究首次观察到二线奥希替尼耐药后出现EGFRT790M⁃G796S⁃L858R 和T790M⁃G796del⁃L858R 双克隆三重（顺式）复合耐药突变的晚期肺腺癌患者1 例，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病例来源

选取2016年9月来中南医院就诊并确诊为晚期肺腺癌的患者1 例。该患者为女性，年龄68 岁，住院期间进行了肺癌相关的基因检测及靶向治疗，且诊疗经过资料完整。

1.2 试剂与仪器

人类EGFR突变检测试剂盒、人类EGFR突变检测试剂盒（多重荧光PCR 法）、FFPE 核酸提取试剂盒及游离DNA 提取试剂盒（厦门艾德生物科技有限公司，中国福建），人类EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒及配套分析软件（北京诺禾致源科技股份有限公司，中国北京）。TTF⁃1、Ki⁃67、ALK、Ber⁃EP4、CD147、CK20、CK5/6、CK7、MOC31、NapsinA、P63、VILLIN鼠抗人单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国北京），PD⁃L1 抗体（22C3，Merck & Co.，Inc.，美国）。全自动免疫组化染色仪（Leica BOND⁃Max，Leica 公司，德国），全自动免疫组化染色仪（DAKO Link 48 平台，Agilent 公司，美国），荧光定量PCR 仪（Mx3000p，Agilent 公司，美国），DA8600 基因测序仪（广州达安基因股份有限公司，广州）。

1.3 检测方法

1.3.1 病理诊断

本例患者初次及二次活检标本均采用10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋并常规HE 染色制片，采用全自动免疫组化染色仪进行免疫组织化学染色，病理诊断及免疫组化结果判读均由病理科高年资的诊断医师完成。

1.3.2 ARMS⁃PCR 检测

采用ARMS⁃PCR 检测试剂盒（人类EGFR突变检测试剂盒）对组织样本进行EGFR突变检测，采用Super ARMS⁃PCR 检测试剂盒（人类EGFR突变检测试剂盒（多重荧光PCR 法））对血液样本cfDNA 进行EGFR突变检测，实验操作严格按照说明书进行，FFPE 核酸提取试剂盒及游离DNA 提取试剂盒均由艾德公司配套提供，上机检测于荧光定量PCR 仪上完成。检测覆盖EGFR基因18、19、20、21 号外显子，包括19del、L858R 等EGFR⁃TKI 敏感位点，以及T790M、20INS 等耐药位点。

1.3.3 高通量测序

采用高通量测序试剂盒（人类EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒）对组织样本进行二代测序文库构建及富集，实验操作严格按照说明书进行，上机检测于DA8600 基因测序仪上完成，检测覆盖EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1、NRAS、TP53、MET、RET、NTRK1等26 基因panel，突变类型涵盖点突变、插入/缺失、基因融合、拷贝数变异等，有效测序深度大于3000X。数据分析由配套分析软件及诺禾致源公司生信团队辅助完成。

2 结果

2.1 临床资料

女性患者，68 岁，无烟酒嗜好，因“咳嗽5 天咯血半天”于2016年9月28日来中南医院就诊；入院后完善相关辅助检查，胸部CT 示：右肺门结节，见图2；PET⁃CT 示：右肺门结节，胸膜多发结节，右侧肾上腺转移。经皮肺穿刺病检结果示（图1）：1.腺癌（中等分化），部分呈粘液腺癌图像；2.免疫组化结果：ALK（lung）（-），Ber⁃EP4（+），CD147（-），CK20（-），CK5/6（-），CK7（-），Ki⁃67（+，30%），MOC31（+），NapsinA（+），P63（-），TTF⁃1（+），VILLIN（-）。诊断为右肺腺癌伴纵膈淋巴结转移、双侧肾上腺转移T3N2M1 Ⅳ期。于中南医院病理科行EGFR基因检测（ARMS⁃PCR 平台），结果提示EGFR21号外显子检测出L858R突变，见图3A。

图1 初诊及再次肺穿刺活检病理学诊断Figure 1 Pathological diagnosis of lung biopsy at the first time and again

图2 患者治疗过程中胸部CT 表现Figure 2 CT findings of the chest during treatment

图3 本例晚期肺腺癌患者基因检测结果Figure 3 The results of genetic testing in this patient with advanced lung adenocarcinoma

2.2 治疗经过

患者于2016年10月行吉非替尼（250 mg，po，qd）靶向治疗，期间中南医院复查CT 均示病情稳定，治疗17 个月后，于2018年4月本院门诊CT示：右肺中叶结节较前稍增大，纵膈淋巴结及双侧肾上腺结节较前无明显变化。提示病情进展，于2018年5月行右肺放疗SBRT（50 Gy/5 F），同时继续原吉非替尼靶向治疗，患者一般情况较好。

于2019年8月因“间断右侧腰部绞痛4 天余”再次入院，中南医院胸部、全腹部CT 平扫示：右肺肿块较前进展，双肺弥漫性小结节，考虑肺内转移；双侧肾上腺结节。给予抗感染、化痰、解痉等对症治疗，患者腰部疼痛完全缓解。考虑到该患者肺肿瘤一线靶向治疗后进展，且近期咳嗽、咳痰明显不宜立即手术，遂于本院病理科行血液cfDNAEGFR基因检测，结果示EGFRT790M⁃L858R 突变，见图3B，于2019年9月开始改为口服奥希替尼（80 mg，po，qd）靶向治疗，治疗期间病情稳定。

于2021年1月复查CT 示：右肺门肿块较前明显增大提示病情进展。再次经皮肺穿刺病检结果（图1）示腺癌，免疫组化：PD⁃L1（阴性，TPS<1%），检测平台：DAKO Link 48，22C3。肺癌26 基因NGS 检测结果示（图3C）：EGFR21 号外显子L858R 突变（丰度85.93%），20 号外显子T790M 突变（丰度85.69%），20 号外显子G796S 突变（丰度58.12%），20 号外显子G796del 缺失突变（丰度20.20%）；其中T790M 和G796S、G796del 均为顺式突变。于2021年2月开始行化疗联合抗血管生成治疗（培美曲塞800 mg+奈达铂100 mg，安维汀400 mg），两个周期治疗后评估临床疗效为SD，遂继续行化疗联合贝伐单抗治疗，共治疗四个周期；2021.5。胸部CT 示肿块较前无明显变化，因化疗反应不能耐受，遂5.31 行单药贝伐珠单抗400 mg维持治疗，患者目前病情稳定。

3 讨论

EGFR⁃TKI 靶向药的问世彻底改变了肺癌的治疗史，携带EGFR敏感突变的晚期NSCLC 患者推荐首选EGFR⁃TKI 靶向治疗［2］。NEJ002 研究［8］中研究者比较靶向单药（易瑞沙）和传统化疗药（卡铂+紫杉醇）治疗晚期肺腺癌的临床疗效，结果显示易瑞沙显著提高患者中位PFS（10.8 vs 5.4 个月）。本例晚期肺腺癌患者，初诊时携带有EGFR⁃L858R 突变，故一线口服吉非替尼靶向治疗，PFS为17 个月，临床疗效显著。值得注意的是，服用易瑞沙的患者一般在一年左右就会开始耐药，根据进展类型可分为缓慢进展型、局部进展型和快速进展型，前两者推荐继续原EGFR⁃TKI 治疗或加局部治疗，而快速进展型，需二次活检了解T790M 突变状态，根据检查结果是阳性或阴性，推荐二线奥希替尼或含铂双药化疗治疗［2］。本例患者一线易瑞沙治疗17 个月后，CT 示“右肺中叶结节较前稍增大，纵膈淋巴结及双侧肾上腺结节较前无明显变化”，提示疾病局部缓慢进展，故继续原口服易瑞沙，同时右肺放疗，患者病情稳定；再次进展时，血液cfDNA检测结果提示继发T790M⁃L858R 突变（ARMS PCR 平台），因此用药调整为口服奥希替尼治疗。

尽管奥希替尼在一线与二线的相关研究数据中取得了较好的成果，但仍不可避免地会产生获得性耐药，且耐药机制多样，因此在行奥希替尼治疗时，再次活检、连续血浆基因检测是发现耐药机制和指导后续治疗的关键。本例患者奥希替尼耐药后再次活检，NGS 结果提示EGFRT790M⁃G796S⁃L858R 和T790M⁃ G796del⁃ L858R 双克隆顺式复合耐药突变；EGFR⁃G796S 突变的相关研究较少，G796S 突变与G796del 共存更是本病例首次报道。基于当前奥希替尼耐药研究，T790M⁃G796S 顺式突变的肺腺癌患者已不能从EGFR⁃TKI 中获益，因此本例患者治疗方案改为双药化疗+贝伐单抗维持治疗。

EGFR⁃G796S 突变是一种被称为“溶剂前沿”的突变，溶剂前沿是激酶表面许多抑制剂附着的区域，而这一机制可被耐药突变破坏，从而干扰TKI与EGFR激酶区域的结合，诱发耐药。2008年Ju⁃dith［9］等首次报道了头颈鳞癌中发现EGFR⁃G796S罕见突变，但当时头颈鳞癌中EGFR基因的研究热点集中在19 和21 号外显子，对20 号外显子研究较少，故G796S 突变的临床意义尚不清楚。2017年Klempner［10］等首次报道了1 例初诊携带L858R 突变的肺腺癌患者，一线厄洛替尼治疗进展后，ctD⁃NA 检测结果提示继发T790M 突变，行二线奥希替尼治疗后再次进展，二次活检行全基因组测序发现EGFRL858R⁃T790M⁃顺式G796S 三重突变，因该患者存在PD⁃L1 高表达，后续行免疫治疗达到影像学部分缓解。同年Ignatius Ou［11］等人首次报道了EGFRL858R⁃T790M 突变二线奥希替尼治疗的肺腺癌患者，出现G796S/R，L792F/H，C797S/G 和V802F 突变同时存在，且均与T790M 为顺式突变，提示奥希替尼耐药机制复杂，可能出现多种分子改变共存；计算机模拟显示G796 突变干扰了奥希替尼与EGFR激酶结构域的苯基芳环位置结合，从而诱发耐药。

探索奥希替尼耐药的分子机制及研发针对性的新型靶向药是目前研究的热点。第四代EGFR⁃TKI如EAI045［12］、CH7233163［13］、JBJ⁃04⁃125⁃02［14］和BLU⁃945，在克服C797S⁃T790M 顺式突变方面，已进行体外和体内活性测定，但尚未达到临床试验阶段。奥希替尼与一代TKIs 联合用于C797S⁃T790M反式突变已有报道［15］。在C797S 突变和T790M 丢失时，奥希替尼治疗失败后患者仍对一代或二代EGFR⁃TKIs 敏感［3］。但值得注意的是，针对服用奥希替尼进展后出现EGFRL858R⁃T790M⁃顺式G796S 突变的患者，目前尚无有效的治疗策略［16］。

综上所述，EGFR⁃TKIs 耐药是不可避免的临床难题，三代TKI 奥希替尼耐药的分子机制复杂，临床处理棘手，再次活检、连续血液基因分子分型及基于NGS 的检测平台的应用是了解其分子机制及指导未来用药的关键。本例病例提示，对于晚期NSCLC 患者奥希替尼二线治疗进展后出现EGFR多重突变（T790M⁃G796S⁃L858R 和T790M⁃G796del⁃L858R 双克隆复合突变）的患者，在无免疫治疗指征且患者能耐受的情况下，双药化疗+贝伐单抗维持治疗不失为一种较优选择。