参麦注射液对病毒性心肌炎病人外周血自噬及凋亡相关蛋白表达的影响

梁伯平，彭旭光，陈 兰

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的局部或弥漫性炎性病变，属于感染性心肌疾病。在病毒流行期，约5%的病人患有心肌炎，并且这种疾病的发作较为分散。多种病毒感染可导致病毒性心肌炎的发生，尤其是柯萨奇病毒B3(CVB3)[1]。目前，病毒性心肌炎的发病机制尚不清楚，可能的发病机制包括直接病原体损伤和自体抗原/抗体诱导的免疫反应[2]。研究显示，自噬在病毒性心肌炎的致病过程中有重要作用[3]。自噬是宿主应激反应的一部分，通过清除受损细胞质成分，发挥调节细胞稳态的作用[4]。但在病毒性心肌炎的发病机制中，CVB3可利用自噬逃避降解，促进病毒的复制和释放，同时过度激活的自噬还可促进炎症级联反应，并加剧心肌炎的进展[5]。传统中医认为病毒性心肌炎的治疗在于补心益气、滋心养阴。研究显示，以参麦注射液为代表的纯中药制剂，可有效提高病毒性心肌炎病人的临床疗效[6]，但具体机制尚不清楚。故本研究旨在探讨参麦注射液对病毒性心肌炎病人外周血自噬及凋亡相关蛋白表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—2020年7月在重庆市黔江中心医院心血管内科住院的病毒性心肌炎病人152例作为研究对象，其中，男78例，女74例，年龄33～72(53.5±9.8)岁。按照随机数字表法将病人分为观察组和对照组，每组76例。纳入标准：均符合《病毒性心肌炎诊断与治疗指南》[7]；知情同意并签署知情同意书者。排除标准：合并恶性肿瘤者；合并自身免疫性疾病、严重感染者；合并急性心肌梗死及感染性心内膜炎者；入院24 h内死亡者；对参麦注射液过敏者；治疗依从性较差者。两组病人性别、年龄、病程、纽约心脏协会(NYHA)心功能分级、基础疾病等基线资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。本研究获得医院伦理委员会批准。

表1 两组病人基线资料比较

1.2 治疗方法 对照组入院当日即给予休息、吸氧、抗病毒、营养心肌、极化液稳定心电活动等对症治疗。观察组在对照组基础上加用参麦注射液(国药准字Z51020552，雅安华润三九药业公司)40 mL+5%葡萄糖注射液250 mL静脉输注，每日1次。两组在院治疗疗程均为2周，治疗期间禁烟、禁酒、禁食辛辣及油腻食物。

1.3 观察指标

1.3.1 自噬[人卷曲螺旋肌球蛋白样Bcl-2结合蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ)]及凋亡[半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)]相关基因mRNA水平检测 采集病人治疗前及治疗后2周外周血3 mL，提取单核细胞后，采用TRIzol试剂(Takara公司)提取总RNA，进行逆转录，逆转录方法按试剂盒(Takara公司)说明进行，自噬相关基因(Beclin-1、LC3-Ⅱ)和凋亡相关基因(Caspase-3、Bcl-2)qPCR引物由上海生工公司合成。建立20 μL反应体系，反应条件：预变性，95 ℃、120 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环；溶解曲线：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA水平。

1.3.2 自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3-Ⅱ)表达水平检测 提取病人治疗前及治疗后2周单核细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。电泳分离，每孔加入50 μg蛋白电泳完成后转移置硝基纤维素膜。采用牛血清白蛋白封闭，与稀释的一抗进行孵育，抗Beclin-1抗体(1∶300)、抗LC3抗体(1∶400)及抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶800)。次日孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)。以GAPDH为内参，计算目的条带与GAPDH灰度比值。

1.3.3 心功能检测 采用超声心动图检测各组病人治疗前后左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)及左室收缩末期内径(LVESD)。

1.3.4 外周血炎性指标检测 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定两组病人治疗前后外周血白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平，具体方法参照试剂盒说明书(武汉博士德生物公司)。

2 结 果

2.1 两组自噬相关基因mRNA和蛋白表达水平比较 治疗前，两组病人外周血单核细胞中自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA及蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组病人自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA及蛋白表达均较治疗前明显降低，其中观察组较对照组降低更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图1。

表2 两组治疗前后自噬相关基因mRNA水平比较(±s)

与治疗前比较，＊P<0.05；与对照组治疗后比较，# P<0.05。

2.2 两组凋亡相关基因 mRNA表达水平比较 治疗前，两组病人外周血单核细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组病人Caspase-3 mRNA水平较治疗前明显降低，而Bcl-2 mRNA较治疗前明显升高，且观察组治疗后Caspase-3 mRNA水平较对照组降低更明显，而Bcl-2较对照组升高更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组凋亡相关基因mRNA水平比较(±s)

2.3 两组血清炎性指标水平比较 治疗前，两组病人血清IL-6、TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组血清IL-6、TNF-α水平均较治疗前明显降低，其中观察组较对照组降低更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 两组血清IL-6、TNF-α水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.4 两组心功能指标比较 治疗前，两组LVEF、LVEDD、LVESD比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

治疗后，两组LVEF、LVEDD、LVESD均较治疗前明显改善，且观察组改善程度明显优于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 两组LVEF、LVEDD、LVESD比较(±s)

2.5 两组不良反应比较 治疗期间，观察组发生头痛1例，恶心呕吐2例，皮疹1例，对照组发生恶性呕吐1例，头痛2例；观察组不良反应发生率为5.3%，对照组为3.9%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组不良反应均较轻微，未经特殊处理症状均自行消失。

3 讨 论

病毒性心肌炎是一种由病毒感染引起的以心脏炎性细胞浸润为特征的心脏疾病，部分病人预后不良，可能会发展为扩张型心肌病和充血性心力衰竭。CVB3是引起病毒性心肌炎最常见的病毒亚型[1]，但其发病机制尚不明确，严重制约了该疾病的防治。中医认为，病毒性心肌炎属胸痹、怔忡，发病源于气阴两虚、热毒伤心，治疗上强调益气养阴、活血化瘀为主[8]。针对病毒性心肌炎采用中西医结合治疗，是目前临床较为理想的治疗方案。相关研究显示，纯中药制剂参麦注射液可改善心功能，显著提高慢性心力衰竭及病毒性心肌炎病人临床疗效，已广泛运用于临床[6，9]，但具体机制还有待阐明。

研究显示，CVB3除了可引起心肌细胞但直接损伤外，还可激活持续性炎症反应，促进心肌细胞凋亡甚至坏死，而持续性的炎症反应与机体自噬系统的激活密切相关，在病毒感染过程中，病毒利用自噬逃避降解，促进病毒复制和释放，同时病毒感染后，细胞膜产生重组，增加双层膜囊泡的数量[10]。自噬体的双层膜结构为病毒复制提供了平台，并保护其免受天然免疫系统的识别和降解。此外，CVB3可在受感染的心肌细胞中复制，除了心肌细胞以外，也可感染心脏成纤维细胞，并且其复制能力比在心肌细胞中更高[11]。病毒感染激活的自噬会促进炎症反应，使用CVB3刺激心肌细胞和心脏成纤维细胞，导致炎性因子的产生和释放增加，从而加重心肌炎的进展[12]。抑制过度的自噬可以有效减少炎性因子的合成与释放[13]。因此，在病毒感染阶段，抑制自噬可有效抑制病毒复制，减少心肌细胞的凋亡与坏死。参麦注射液主要由红参合和麦冬组成，具有滋阴补气、养阴生津之功效。研究表明，参麦注射液可显著改善慢性心力衰竭病人心肌能量代谢，降低炎症反应，改善心功能[14]。本研究结果显示，参麦注射液可显著抑制病毒性心肌炎病人过度的自噬水平和细胞凋亡，主要表现为使自噬相关基因(Beclin-1、LC3-Ⅱ)和细胞凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平明显降低。研究证实，过度的自噬可诱发细胞凋亡，线粒体依赖性途径是细胞凋亡的重要机制，自噬通过对线粒体的大量降解，抑制了机体能量代谢，促进了细胞凋亡及相关促炎细胞因子的分泌[15]。在本研究中，参麦注射液可显著降低病毒性心肌炎病人炎症水平，即IL-6和TNF-α水平，其可能与抑制过度的自噬有关。心功能指标的变化可有效反映病毒性心肌炎病人临床治疗效果及预后，本研究结果显示，参麦注射液可显著改善心功能指标如LVEF水平显著升高，而LVEDD和LVESD水平显著降低(P<0.05)。观察组病人不良反应发生情况与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。少数出现不良反应的病人，症状较轻，未经特殊处理症状均自行消失，提示参麦注射液在改善急性病毒性心肌炎病人临床治疗效果的同时，并未增加相关不良反应的发生率。参麦注射液通过抑制病毒性心肌炎病人机体自噬和凋亡水平，有助于降低炎症反应、改善心功能，但是否可进一步改善其预后水平，还需进一步研究。

综上所述，参麦注射液治疗病毒性心肌炎效果确切，其可降低外周血单核细胞自噬及凋亡水平，抑制炎症反应的持续放大，从而改善心功能。但鉴于本研究存在一定局限性①参麦注射液如何调控自噬的分子机制尚不清楚，还需要动物及细胞实验进一步研究；②本研究样本量偏少，同时也是单中心研究，希望下一步加大样本量，采取多中心研究予以证实上述研究结果。