一株耐冷微生物的分离鉴定及降解特性研究

孙梓轩，陈亚军

（定西市食品检验检测中心，甘肃 定西 743000）

耐冷菌是一类能在低温环境下正常生长的微生物，其最适生长温度一般高于15 ℃，最高生长温度高于20 ℃，在0～5 ℃也能正常繁殖。耐冷微生物在环境中分布广泛，研究发现，从常温土壤、低温污水、人工湿地、活性污泥等环境中均可分离出耐冷菌。目前已知的耐冷微生物以细菌居多，最常见的是假单胞菌属，耐冷真菌中以酵母菌最为常见。目前，耐冷菌研究逐渐从前期的分离鉴定和耐冷机制向应用方面扩展，尤其是北方寒冷地区生活污水、工业污水、养殖污水等方面的应用研究较多。研究结果均表明，耐冷菌在低温环境下对废水中的COD能达到较高的降解效率，应用前景较好。

近年来，甘肃省定西市以马铃薯为原料的淀粉和淀粉制品加工企业日益壮大，淀粉加工会产生大量的高浓度有机废水，其COD含量高，超过30 000 mg/L。生物法是目前污水处理的主要方法，通过微生物的代谢和一系列酶促反应作用，使废水中的有机物质被降解利用，从而降低废水中的COD含量，使污水得到净化。但是，低温环境往往使微生物活性受到抑制，降低了微生物的生长代谢，导致低温条件下的污水处理效果差。定西市淀粉生产集中在每年10—11月，此时环境温度小于10 ℃，这给淀粉废水的生物处理带来较大困难。本研究从低温储藏食品浆水中分离并筛选对废水具有较高降解能力的耐冷菌株，这对提高本地区低温环境下淀粉废水的处理效果具有重要意义。

1 试验材料和方法

1.1 材料

本试验菌种从甘肃省定西市的传统特色食品浆水样品中分离得到。培养基分为Luria-Bertani（LB）培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，二者购于北京陆桥生物技术有限责任公司；NaCl、NaHPO、KHPO（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司；生化鉴定反应试管购于广东环凯生物科技有限公司。马铃薯淀粉加工废水样品采自定西市临洮县云鹏薯业有限责任公司，其初始COD约为45 000 mg/L。

1.2 仪器与设备

一是SPX-350B智能型生化培养箱，由上海琅玕试验设备有限公司生产；二是JA5003电子天平，由上海良平仪器仪表有限公司生产；三是EX30光学显微镜，由宁波舜宇光电信息有限公司生产；四是K6600B全波长酶标仪，由北京凯奥科技发展有限公司生产；五是SP-756P紫外分光光度计，由上海光谱仪器有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 耐冷菌株的分离纯化

将采集的浆水样品摇匀，然后取1 mL进行10倍系列稀释。稀释液为无菌生理盐水。接着，选取10～10倍的稀释液各0.1 mL涂布于LB培养基和PDA培养基平板上，每个稀释度设3个平行样，于5 ℃下培养至有菌落生长，挑取生长状况较好的单菌落反复分离纯化，记录所筛选耐冷菌株的形态特征。纯化后的菌落用超低温冷冻保存法储存。

1.3.2 耐冷菌株的筛选

将分离纯化的耐冷菌株于温度10 ℃、转速140 r/min的条件下振荡培养48 h后，按照10%接种量接种于50 mL淀粉废水中，以不加菌液的淀粉废水为空白对照，10 ℃、140 r/min条件下培养，每组设3个重复样，每3 d取样测定废水的COD值，直至COD值不再下降，然后选取对废水COD具有较好降解性能的菌株进行鉴定。COD的测定采用《水质 化学需氧量的测定 快速消解分光光度法》（HJ/T 399—2007）。

1.3.3 耐冷菌株的鉴定

对筛选得到的耐冷菌株进行生理生化特性研究，同时进行分子生物学鉴定，细菌采用16SrDNA序列鉴定，一级酵母采用26SrDNA序列鉴定，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，检测序列通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行比对，采用MEGA-X软件绘制系统发育树。

2 试验结果分析

2.1 耐冷菌株的分离纯化

浆水样品经过5 ℃低温培养，共分离出4株耐冷菌株，分别命名为J1、J2、J3和J4，经过显微镜初步观察，J2为革兰氏阳性球菌，其余疑似酵母菌。平板纯化培养发现，J1、J4菌株具有明显的生长优势，选取这两株菌株进行进一步筛选。从菌株在PDA培养基平板上的菌落形态来看，J1菌落为圆形，呈瓷白色，表面干燥粗糙，不透明，边缘整齐；J4为圆形，属于绒毛样白色凸起菌落，表面粗糙，干燥，边缘整齐，不透明。

2.2 耐冷菌株的筛选

J1、J4菌株以及不加菌株的空白对照组对淀粉废水COD的去除率如图1所示。在处理的第6天，对照组COD去除率较高，达到66.11%；J1菌株处理组也显示出较高的COD去除率，达到50.88%，但低于对照组。随着培养时间的延长，J4菌株处理组对淀粉废水COD的去除率逐渐增加，处理第9天的COD去除率达到79.14%，统计学差异分析结果显示，其和对照组的COD去除率差异显著（概率小于0.05）。结果说明，所用淀粉废水中存在土著耐冷微生物，它们自身具有降解淀粉废水中有机物质的能力，因此对照组也显示出较高的降解效率，而且土著微生物可能会和加入的外来菌株产生一定的拮抗反应，从而影响菌株的废水处理效果，所以耐冷菌株的筛选除了自身降解性能外，还需要考虑其和废水中土著微生物的相互作用。另外，有些菌株在生长过程中会产生部分对自身生化反应有负反馈作用的代谢产物，从而抑制生化反应。因此，结合低温生长优势，本研究选择J4菌株进行后期鉴定。

图1 耐冷菌株在10 ℃低温环境下对淀粉废水COD的去除率

2.3 菌株鉴定

2.3.1 生理生化鉴定

对所分离菌株J4进行硝酸盐还原、尿素水解、明胶水解、淀粉水解、触酶试验、糖发酵（葡萄糖、核糖、果糖、木糖等）试验等生理生化特性研究。其中，触酶、葡萄糖、木糖、半乳糖反应结果为阳性，其余项目反应结果为阴性。

2.3.2 分子生物学鉴定

将J4菌株26SrDNA基因序列进行同源性比对分析，结果发现，与该菌株同源性较高的大部分属于地霉属（sp.）菌株，其与白地霉（）的同源性高达99.8%，结合菌株形态特征和生理生化特性，菌株J4被初步鉴定为白地霉，属于酵母菌中的地霉属。

3 结论

浆水是在各种微生物作用下发酵而成的酸味地方特色食品，为了保持风味，成品浆水一般在低温环境储存，这也为耐冷微生物的生长提供了温床。因此，本研究从浆水中分离出一株耐冷菌株J4，其对马铃薯淀粉加工废水的COD具有较好的降解效果，在10 ℃温度下，处理第9天的COD去除率可达到79.14%。通过26SrDNA基因序列和同源性比对，结合生理生化特性，初步确定菌株J4属于白地霉。本研究所用淀粉废水为从厂家实地采集的马铃薯淀粉加工过程的工艺段废水，也被称为蛋白液，其含有大量的蛋白质、多糖、矿物质等，它们成为淀粉废水的主要污染源，其COD含量保持在39 000～45 000 mg/L。丰富的营养物质加之低温环境，使得淀粉废水含有复杂的土著耐冷微生物。本研究的对照组对淀粉废水COD的去除率在第6天可达66.11%，也佐证了这一观点。土著微生物的存在可能会对外加菌株的处理效果产生影响，因此利用耐冷菌株在低温环境处理淀粉废水时，要关注土著微生物和不同耐冷菌株的相互作用。