徐 言,陈季旺,2,*,莫加利,廖 鄂,2,彭利娟,2,夏文水,3,*
(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北 武汉 430023;2.武汉轻工大学 农产品加工与转化湖北省重点实验室,湖北 武汉 430023;3.江南大学食品学院,江苏 无锡 214122)
草鱼是我国淡水养殖鱼类中产量最大的品种。2019年,我国大宗淡水鱼养殖总产量为2 548.03万 t,其中草鱼养殖总产量为553.31万 t,约占我国淡水养殖产量的1/5。目前草鱼的国内市场需求仍以鲜活鱼为主,加工产品比例较低,这使得草鱼销售受到地域局限,限制了渔民的收入。因此,开发新型的草鱼加工制品,可有效增加草鱼的附加值,提高渔民收入,促进乡村振兴。
烧烤鱼制品是指将去鳞、头、尾、内脏后脱腥腌制的鱼块置于木炭或电加热装置中烤熟,并加以调味制成的风味鱼制品。烤制是烧烤鱼制品加工过程中的重要工序,是赋予鱼肉特定质构、色泽和风味的关键步骤。烤制过程中鱼肉蛋白质的热变性、脂肪的氧化及Maillard反应赋予了烧烤鱼制品独特口感和特殊烧烤风味。但目前鱼制品烧烤主要以路边摊或小作坊的形式生产,缺乏规范化生产模式,存在品质参差、具有安全隐患等问题。如烧烤鱼制品常出现油脂含量过高、肉质过硬等品质问题,以及脂肪氧化过度产生致癌物等安全性问题。因此,亟需改善淡水鱼烧烤制品的品质,提高其安全性。目前,有关烤制对鱼肉质构、风味、安全性等影响的报道较少。胡吕霖研究了经不同烤制时间处理的鲟鱼硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reacitive substances,TBARS)值、巯基含量等的变化。结果显示,随着烤制时间的延长,巯基含量逐渐降低,TBARS值呈先升高后降低的趋势。李海燕等通过测定酸价(acid value,AV)、过氧化值(peroxide value,POV)、TBARS值和羰基价研究了茶多酚对烤鲶鱼脂肪氧化的影响。结果显示,茶多酚能够显著抑制烤鲶鱼的脂肪氧化进程。
本实验以鲜活草鱼为原料,通过测定不同烤制温度(180、200、220 ℃)、烤制时间(10、15、20 min)下烧烤草鱼块的嫩度、色度、感官评分,水分、灰分和脂肪质量分数,脂肪氧化程度(AV、TBARS值)、挥发性成分相对含量及鱼肉蛋白质理化性质(二级结构、表面疏水性指数()、总巯基和二硫键含量)的变化,探讨烤制温度和时间对烧烤草鱼块品质的影响,以期为烧烤鱼制品的规模化加工提供科学指导和技术支撑。
鲜活草鱼()(约1.5 kg/尾)湖北允泰坊食品有限公司;金龙鱼大豆油 益海嘉里(武汉)粮油工业有限公司;绿茶 武汉市云雾茶叶有限公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、1-苯胺基萘-8-磺酸盐(anilinonaphthalene-8-sulfonate,ANS)上海源叶生物化学试剂有限公司;尿素、硫氰酸胍、亚硫酸钠、甘氨酸等 国药集团化学试剂有限公司。
CR-10色差计 柯尼卡美能达(中国)投资有限公司;C-LM3B数显式肌肉嫩度仪 北京龙德泰达生物技术有限公司;WHJ7200分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;DW-60W388超低温冰箱 海尔生物医疗股份有限公司;FD-1-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;NEXUS670傅里叶红外光谱仪 美国尼高力仪器公司。
1.3.1 烧烤草鱼块制备工艺
鲜活草鱼→预处理→切块→脱腥→腌制→脱盐→穿串→干燥冷却→烤制→成品
原料预处理:将鲜活草鱼去鳞、内脏、污血等,然后切去头、尾、腩、鳍,从腹部沿中轴骨剖片,逐片清洗,将腹腔内的黑膜刮掉,去刺(注意不要破坏鱼体的完整性),最后流水冲洗鱼体内外。
草鱼块的制作:将清洗干净的鱼片纵向切成大小厚薄基本一致的鱼块(7 cm×2 cm×1.5 cm),每块17~21 g。
脱腥:将绿茶叶放入沸水中泡开,茶叶与水比例为1∶50(/),冷却至室温(25 ℃),滤掉茶叶。将草鱼块浸泡于茶汤中,于冰箱的冷藏室(4 ℃)中脱腥30 min,鱼块和茶汤比例为1∶2(/)。
腌制:将脱腥后的草鱼块放在不锈钢架上,使鱼体中的水分自然滴下,用纸将草鱼块表面水分轻轻吸干,然后将草鱼块放置在洁净干燥的不锈钢盆中,用6%(以鱼块质量计)的食盐缓慢均匀地涂抹于鱼块表面,保鲜膜密封。将装有草鱼块的不锈钢盆置于冰箱的冷藏室(4 ℃)腌制4 h。
脱盐:将腌制后的草鱼块放入盛有自来水的不锈钢盆中脱盐,草鱼块和清水的比例为1∶4(/),重复淘洗两次,每次1 min。
穿串:将脱盐后的鱼块用竹签沿鱼块长边穿起,每串一块鱼块。
干燥:将串好的草鱼块等间距地放置在铺有纱布的筛网上,上下两层分别放置6 块,于热风干燥箱中40 ℃下干燥2 h。干燥后,取出鱼块,置于铺有纱布的不锈钢托盘中,自然冷却至室温(25 ℃)。
烤制:将鱼块两面刷大豆油,置于烧红的电烤网上烤制,上下两层分别同方向等间距放置6 块,在烤至规定时间一半时翻动一次。烤制条件:温度分别为180、200、220 ℃时烤制15 min;温度为200 ℃时分别烤制10、15、20 min。
成品:将烤制后的草鱼块置于铺有纱布的不锈钢托盘中,自然冷却至室温(25 ℃),备用。以未烤制的草鱼块作为对照。
1.3.2 色度的测定
色度的测定参考Ganasen等的方法并稍作修改。将烤制后的草鱼块冷却至室温(25 ℃),采用便携式色差仪测定鱼块表面的亮度*值、红绿度*值、黄蓝度*值。测定色度时,将鱼块样品对准且紧贴色差仪镜头口。
1.3.3 剪切力的测定
参考NY/T 1180—2006《肉嫩度的测定 剪切力测定方法》测定鱼块嫩度。
1.3.4 感官评价
由10 名食品大分子和生物活性物质实验室的食品专业研究生组成感官评价小组,对烧烤草鱼块的5 个指标进行评价,感官评分标准参考李海燕等的方法并稍作修改。评价人员评分前先温水漱口,再按感官评价标准对烧烤草鱼块的各个指标评分。总分为各项目得分之和感官评价标准见表1。
表1 烧烤草鱼块的感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of roasted grass carp fillets
1.3.5 水分质量分数的测定
参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法测定烧烤草鱼块中水分质量分数。
1.3.6 脂肪质量分数的测定
参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》测定烧烤草鱼块中脂肪质量分数。
1.3.7 灰分质量分数的测定
参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定烧烤草鱼块中灰分质量分数。
1.3.8 酸价的测定
参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》测定烧烤草鱼块的AV。
1.3.9 硫代巴比妥酸反应物值的测定
参照GB/T 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》的分光光度法测定烧烤草鱼块的TBARS值。
1.3.10 挥发性成分相对含量的测定
样品制备:参考蒋晨毓等的方法。将烧烤草鱼块与0.18 g/mL NaCl溶液以1∶1(/)混合,充分均质后,取5 g置于20 mL顶空瓶中待测。
气相色谱条件:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度40 ℃保持2 min,以4 ℃/min的速率升至160 ℃,立即以10 ℃/min的速率升至250 ℃,保持3 min;载气为He,流速1.0 mL/min;模式为进样不分流。
质谱条件:电子能量70 eV、灯丝发射电流200 μA、离子源温度230 ℃、四极杆温度150 ℃、检测器温度250 ℃、接口温度250 ℃、检测器电压1.2 kV、质量扫描范围/35~450、传输线温度280 ℃、扫描离子采集(SCAN)。
1.3.11 肌原纤维蛋白的提取
肌原纤维蛋白的提取参照Ren Lina等的方法并稍作修改。将烤制后的鱼块放入绞肉机中绞碎,准确称取4 g,加入5 倍体积的0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0),15 000 r/min匀浆10 s;4 ℃、10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,重复洗涤沉淀2 次;沉淀加入4 倍体积的0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0),15 000 r/min匀浆5 s。4 ℃静置30 min以充分溶解肌原纤维蛋白,4 ℃、10 000 r/min离心20 min,离心后取上清液,贮藏在冰箱的冷藏室(4 ℃)中备用。
1.3.12 总巯基和二硫键含量的测定
总巯基含量的测定参考Yongsawatdigul等的方法并稍作修改。将肌原纤维蛋白溶液用0.6 mol/L KCl溶液稀释至4 mg/mL,取1 mL加入4 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(含0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素,pH 7.0)。取4 mL混合溶液,加入0.4 mL含0.1%(质量分数)DTNB的Tris-HCl缓冲液(0.2 mol/L,pH 8.0),40 ℃水浴25 min。于412 nm波长处测定吸光度。巯基含量按式(1)计算,以mol/10g蛋白质计。
式中:为吸光度;为摩尔吸光系数(13 600 L/(mol·cm));为稀释倍数。
二硫键含量的测定参考Balange等的方法,用2-硝基-5-硫代磺基苯甲酸酯(2-nitro-5-thiosulfobenzoate,NTSB)试剂测定。100 mg DTNB溶于10 mL 1 mol/L的亚硫酸钠溶液中,调节pH值至7.5,与新配制的缓冲液(2 mol/L硫氰酸胍、50 mmol/L甘氨酸、100 mmol/L亚硫酸钠、3 mmol/L EDTA)按体积比1∶100稀释,pH值调至9.5,得到NTSB检测溶液。取0.5 mL 0.5 mg/mL肌原纤维蛋白溶液,加入3.0 mL NTSB检测溶液(pH 9.5),充分混匀后在暗处放置25 min,412 nm波长处测定吸光度。二硫键含量按式(2)计算,以mol/10g蛋白质计。
式中:为吸光度;为摩尔吸光系数(13 900 L/(mol·cm));为稀释倍数。
1.3.13 表面疏水性的测定
表面疏水性的测定参考Riebroy等的方法并稍作修改。采用ANS作为荧光探针。将肌原纤维蛋白溶液用0.6 mol/L KCl-10 mmol/L磷酸缓冲液(0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素,pH 7.0)稀释成0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL系列蛋白质量浓度的溶液。取4 mL稀释的蛋白质溶液,加入20 μL ANS溶液(8 mmol/L、pH 7.0),振荡混匀,在暗处放置15 min后进行测试。以蛋白质量浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图,曲线初始段的斜率即为肌原纤维蛋白的表面疏水性指数()。
1.3.14 蛋白质二级结构的测定
蛋白质的二级结构的测定参考Chen Xing等的方法并稍作修改。将烧烤草鱼块冷冻干燥72 h后粉碎,称取适量冻干的烧烤草鱼块粉于研钵中,并按照1∶100(/)的比例加入溴化钾(KBr),充分混匀并研磨后进行压片测定,用空气作为空白进行测定并扣除背景,400~4 000 cm光谱范围扫描32 次,分辨率4 cm,采用Peakfit软件对酰胺I带吸收峰(1 600~1 700 cm)进行拟合。
每组实验数据重复测定3 次,实验结果以平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0软件进行进行方差分析,采用Duncan多重极差检验比较平均值在显著性水平上的差异,<0.05判定为差异显著,>0.05判定为差异不显著。采用Origin软件作图。
适度热处理可以改善鱼肉质构特性和色泽。过度加热造成鱼肉蛋白质严重变性,水分迅速流失,质地变硬,色泽较差,严重影响烧烤鱼制品的品质。烤制温度和时间对烧烤草鱼块剪切力、色度和感官评分的影响见表2。
表2 烤制温度和时间对烧烤草鱼块剪切力、色度和感官评分的影响Table 2 Effects of roasting temperature and time on shear force, color,and sensory score of roasted grass carp fillets
与对照组相比,不同烤制温度或烤制时间下草鱼块的*值、*值和*值均显著升高(<0.05)。这可能与Maillard反应产生有色物质及脂质氧化反应有关。随着烤制温度的升高或烤制时间的延长,*值呈现下降的趋势,*值和*值总体均呈现上升的趋势,色泽不断加深。这可能是高温使鱼肉蛋白质变性,加速了水分蒸发。水分的蒸发使得鱼肉发生表面失水现象,对光的反射减弱,导致*值降低。此外,高温烤制使得Maillard反应加剧,导致烧烤草鱼块呈暗黄且偏红褐色。Chelh等报道了与本研究类似的结果。随着烤制温度的升高,剪切力逐渐增加,可能是温度升高造成草鱼块脱水,水分质量分数降低,导致肌肉组织质地更加紧实有弹性;温度进一步升高,蛋白质变性导致持水性降低,使草鱼肉严重脱水变硬。不同烤制时间下烧烤草鱼块的剪切力无显著性差异(>0.05)。感官评分随烤制温度的升高或烤制时间的延长均呈现出先增加后降低的趋势。这是由于烤制初始阶段随着温度的升高或时间的延长,Maillard反应及脂肪氧化反应的发生赋予烧烤草鱼块较好的风味,其中200 ℃下烤制15 min的烤鱼块具有金黄的色泽,且水分流失较少,鱼肉较紧实,口感较好。而温度过高导致草鱼块失水严重,Maillard反应加剧且脂质过度氧化,最终影响产品的口感和风味。
烤制温度和时间对烧烤草鱼块水分、脂肪和灰分质量分数的影响见表3。随着烤制温度的升高或烤制时间的延长,水分质量分数呈现显著下降的趋势(<0.05)。这可能是草鱼块在热处理的过程中水分蒸发,且随着温度的升高,鱼肉蛋白质的三级结构、二级结构依次被破坏,导致持水性降低。随着烤制温度的升高或烤制时间的延长,脂肪质量分数呈现先下降后上升的趋势。这可能是由于加热初期水分流失带走了部分脂肪;而在较高温度(220 ℃)或较长烤制时间(20 min)下,随着水分的蒸发,部分脂肪重新沉积在鱼块表面,且鱼肉蛋白质发生变性,形成硬膜,阻碍了鱼块内部脂肪的散失,导致脂肪质量分数增加。许雪萍在对猪肉烤制过程脂肪含量变化机制的研究中也得到了类似的结果。烤制后的草鱼块灰分质量分数显著高于对照组(<0.05),可能是烤制过程中伴随着水分的流失,水溶性蛋白质和脂肪也逐渐流失,导致肉中的灰分含量相对升高。随着烤制温度的升高或烤制时间的延长,灰分质量分数呈先减少后增加的趋势。这可能是烤制温度较低或时间较短时,水分、水溶性蛋白等营养物质流失速率较慢,同时有矿物质流失,因此灰分质量分数相对降低;随着温度的升高或烤制时间的延长,鱼肉中的矿物质流失速率小于水分、可溶性蛋白质的流失速率,使得灰分质量分数相对升高。
表3 烤制温度和时间对烧烤草鱼块水分、灰分和脂肪质量分数的影响Table 3 Effects of roasting temperature and time on moisture, ash, and fat contents of roasted grass carp fillets
测定烤制过程中TBARS值可以直接反映加工过程中脂质的氧化程度。AV则能够反映烧烤鱼块中的游离脂肪酸的总量,是衡量脂肪水解程度的指标。
烤制温度和时间对烧烤草鱼块脂质氧化的影响见图1。随着烤制温度的升高,TBARS值呈先增加后减少的趋势,在200 ℃时达到最大值(16 mg/kg)。这可能是烤制初期随着烤制温度的升高,脂质氧化加快,氧化产生的初级产物迅速分解为次级产物丙二醛等,导致TBARS值显著增加;烤制温度高于220 ℃,TBARS值显著下降(<0.05),可能与脂质氧化产物和蛋白质水解反应产物(例如氨基酸)在高温下发生反应有关。随着烤制温度的升高,AV呈显著上升趋势(<0.05)。这可能是温度的升高使鱼肉脂质发生水解,产生游离脂肪酸所致。此外,脂质水解产生的游离脂肪酸更易发生氧化分解,形成的有机酸类也可能导致AV持续上升。随着烤制时间的延长,TBARS值显著升高(<0.05),可能是烤制时间延长,草鱼块温度不断上升,脂质持续氧化所致;AV显著升高(<0.05),可能是脂肪氧化分解所产生的游离脂肪酸大量积累所致。
图1 烤制温度(A)和时间(B)对烧烤草鱼块TBARS值和AV的影响Fig. 1 Effects of roasting temperature (A) and time (B) on TBARS and AV values of roasted grass carp fillets
烤制温度和时间对烧烤草鱼块挥发性成分的影响见表4、5。随着温度的升高或烤制时间的延长,醛类物质的相对含量先降低后增加,且整体呈下降的趋势,这与李冬生等在研究高温油炸武昌鱼醛类物质变化时得到的结果类似。醛类物质是脂质降解的主要产物,具有脂肪香味,且阈值较低,通常对鱼的整体香气具有重要贡献。醛类物质相对含量的降低意味着高温导致鱼肉自身风味的损失。其中,饱和直链醛壬醛在草鱼块烤制过程中均存在且含量相对较高,可能对产品最终的风味有重要作用。鱼肉中的醇类主要来自脂质的氧化分解产生。C~C的醇类化合物与形成鱼肉中的腥味物质有关,尤其是1-辛烯-3-醇,具有类似青草、泥土和蘑菇的气味,是鱼肉中的腥味成分之一,随着温度的升高或烤制时间的延长,醇类物质的相对含量呈下降趋势,说明高温处理有助于消除新鲜鱼肉的土腥味。这与施文正等对不同温度条件下草鱼肉挥发性成分的检测结果类似。温度升高或时间延长条件下都检测到了2-戊基呋喃,其被认为对肉制品的整体风味有较大贡献。由于烧烤草鱼块中不饱和脂肪酸的含量相对较高,容易氧化降解产生高含量的2-戊基呋喃等挥发性物质,构成了烧烤草鱼块独特的烧烤香味。此外,烤制过程中检测出了部分烃类、酯类、酮类及芳香族物质,由于其含量较低且阈值较高,对烧烤草鱼块风味贡献较小。
表4 烤制温度对烧烤草鱼块挥发性成分含量的影响Table 4 Effects of roasting temperature on volatile component contents in roasted grass carp fillets
表5 烤制时间对烧烤草鱼块挥发性成分含量的影响Table 5 Effects of roasting time on volatile component contents in roasted grass carp fillets
肌原纤维蛋白的聚集是高温条件下蛋白质变性引起的主要变化,会影响鱼肉的品质。巯基是蛋白质中重要的活性基团,在维持蛋白质的天然结构和功能上起着重要作用。因此,巯基含量的变化可以反映蛋白质的变性程度。蛋白质的表面疏水性反映的是蛋白质分子表面疏水性氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸残基等)的相对含量。当蛋白质的空间构象发生改变时,其内部的疏水性氨基酸暴露,从而改变蛋白质的表面疏水性,所以蛋白质表面疏水性可以表征蛋白质构象的变化。烤制温度和时间对烧烤草鱼块肌原纤维蛋白总巯基、二硫键含量及表面疏水性的影响见表6。
表6 烤制温度和时间对烧烤草鱼块肌原纤维蛋白总巯基、二硫键含量及表面疏水性的影响Table 6 Effects of roasting temperature and time on the contents of total sulfhydryl group and disulfide bond and surface hydrophobicity of myofibrillar protein from roasted grass carp fillets
随着烤制温度的升高或烤制时间的延长,总巯基含量显著降低(<0.05),二硫键含量和则呈显著升高的趋势(<0.05)。这可能是烤制温度升高或长时间烤制使肌原纤维蛋白发生变性展开,蛋白质三级结构、二级结构逐渐被破坏,导致活性巯基暴露,进而发生巯基氧化,总巯基含量下降,形成二硫键;当几乎所有的三级结构和二级结构都丧失时,展开的蛋白质可能发生聚集,形成二硫键侧链修饰,并与其他多肽交联。同时,蛋白质受热伸展使得疏水基团暴露,显著升高,疏水基团的逐渐暴露也会导致肌原纤维蛋白的聚集。
烤制温度和时间对烧烤草鱼块肌原纤维蛋白二级结构的影响如表7所示,随着烤制温度的升高,-螺旋的相对含量显著下降(<0.05),-转角的相对含量总体显著升高(<0.05),-螺旋与-折叠的相对含量之和呈现明显下降的趋势。这说明加热破坏了维持-螺旋结构稳定的氢键,使肌原纤维蛋白的稳定二级结构被破坏,且烤制温度越高破坏程度越严重。同时,-转角和无规卷曲的相对含量之和呈现明显上升的趋势。这也说明了高温烤制促使鱼肉肌原纤维蛋白由稳定状态向不稳定状态转变,鱼肉的凝胶结构被破坏,且烤制温度越高,破坏程度越明显;随着烤制时间的延长,-螺旋和-折叠的相对含量均呈现总体显著下降的趋势(<0.05)。这说明加热破坏了鱼肉肌原纤维蛋白稳定的二级结构,且烤制时间越长破坏程度越严重。同时,-转角和无规卷曲的相对含量之和呈明显上升趋势。这表明高温烤制使草鱼块中的肌原纤维蛋白由-螺旋、-折叠向-转角和无规卷曲转变,蛋白质的结构紧密程度和构象稳定性降低,包埋于分子内部的疏水基团暴露,增强了蛋白质分子间的疏水相互作用;且烤制时间越长,肌原纤维蛋白的变性聚集现象越严重。其中,在200 ℃下烤制15 min对肌原纤维蛋白破坏程度较低,蛋白结构较完整。
表7 烤制温度和时间对烧烤草鱼块肌原纤维蛋白二级结构的影响Table 7 Effects of roasting temperature and time on the secondary structure of myofibrillar protein from roasted grass carp fillets
上述结果进一步验证了烤制温度及烤制时间会对鱼肉肌原纤维蛋白的巯基、二硫键含量以及表面疏水性造成影响,进而改变烧烤草鱼块的水分含量,导致鱼块色泽和鱼肉嫩度发生变化。
烤制温度较低(180~200 ℃)或烤制时间较短(10~15 min)时,鱼肉肌原纤维蛋白发生轻微的变性,部分巯基氧化形成二硫键,且疏水基团逐渐暴露,水分流失较慢,因此,鱼肉变紧致,口感较好。同时,Maillard反应及脂质氧化反应的发生,产生有色物质及香味物质,使鱼块的色泽较好,风味较佳;烤制温度过高(220 ℃)或烤制时间较长(20 min)时,鱼肉肌原纤维蛋白严重变性,巯基持续被氧化,二硫键含量持续增加,大量疏水基团暴露,肌原纤维蛋白发生聚集,导致持水性显著下降,水分快速流失,口感变硬,鱼肉失去弹性。Maillard反应的加剧以及脂质的过度氧化酸败,使得鱼肉色泽变暗失去金黄光泽,且风味发生劣变。