响应面法优化小米油的加速溶剂萃取工艺

康淼，郭瑜，马薇薇，张宏丽，于钰杰，王晓闻

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

小米，谷子经脱壳后制成的粮食，不仅是良好的营养来源，还具有养肾气、健脾胃、清虚解热等功效［1］，与其它谷物相比，小米具有较高含量的脂肪［2］。不同小米的脂肪含量存在差异，这也直接影响到了其营养品质和食用品质［3］。目前消费者对小米的营养价值和感官品质尤为关注，因此小米油脂的含量及脂肪酸组成逐渐成为当前研究的热点。李红等［4］研究发现小米油中亚油酸含量最高（65.30%），其不饱和脂肪酸含量约为饱和脂肪酸含量的5 倍，因此小米油是一种具有保健作用的油脂。赵陈勇等［5］研究小米谷糠油对高血脂型大鼠的血脂水平的影响，结果表明小米谷糠油相比其它谷物油降血脂效果最好。

目前对小米油脂的提取技术主要为索氏提取法，索氏提取法（Soxhlet extraction，SE）是一种传统的提取方法，具有设备要求低和操作简单的特点，但是使用该方法提取油脂的时间太长，且对有机溶剂的消耗量大。加速溶剂萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE）是Richter 等［6］提出的一种可以在高温、高压的条件下实现有机溶剂自动萃取的新型萃取方法。升高温度有助于有机溶剂对样品的溶解，增加压力有助于加快萃取的速度。与传统技术相比，在ASE 提供的条件下，有机溶剂的萃取率更高，这是由于溶质溶解度增加，传质和扩散速率得到改善［7］。ASE 方法经济，耗时少，溶剂使用量低，提取得率高［8］。在目前的提取技术领域，ASE 技术被推荐为各种过程的最佳提取技术之一，这些技术主要集中在草药、食品、药品和以营养为基础的研究和产品开发［9］。

本试验以晋谷21 小米为研究对象，通过加速溶剂萃取仪提取小米中的油脂，并采用单因素试验和响应面法对萃取剂的选择、萃取温度、萃取时间以及循环次数等条件进行优化；同时利用气相色谱质谱联用仪（Gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）对小米油脂脂肪酸的组成进行定性和定量分析，以期建立一种简单、快速地提取小米油脂的方法，为小米的进一步开发及利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米：晋谷21，由山西农业大学生物工程研究所提供。

二氯甲烷：分析纯；正庚烷、甲醇：色谱纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

表1 仪器型号及厂家Table 1 Instrument model and manufacturer

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将除杂后的小米粉碎，过100 目筛后，-80 ℃保存备用。

1.3.2 小米油脂的提取

称取约2 g 的小米粉，将其与硅藻土（2∶1）混合后置于萃取池中。待萃取完毕后，收集萃取液于旋蒸瓶中并浓缩，在60 ℃下烘至恒重。

油脂得率按下列公式计算：

式中：m0为样品质量（g），m1为空旋蒸瓶的质量（g），m2为含脂肪的旋蒸瓶的质量（g）。

1.3.3 试验设计

选择溶剂体积比、萃取温度、萃取时间以及循环次数4 个因素（表2），分析不同因素对小米油脂得率的影响。

表2 单因素变量试验因素水平Table 2 Factor level of single factor variable test

1.3.4 小米油脂脂肪酸组成分析

甲酯化方法 称取油脂0.06 g，加入十一碳酸甘油三酯内标溶液2 mL。再加入4 mL 异辛烷，待试 样 溶解后 加 入200 μL 的NaOH-CH3OH 溶 液并震荡30 s。静置至澄清后加入约1 g NaHSO4震荡，待盐沉淀后，取上层液待用。

色谱条件 进样器温度：270 ℃；检测器温度：280 ℃；载气：氮气；程序升温：100 ℃维持13 min，10 ℃·min-1升温至180 ℃，保持6 min；1 ℃·min-1升温至200 ℃，维持20 min；最后以4 ℃·min-1的速率升温至230 ℃，维持10.5 min；分流比：100∶1；进样体积：1.0 μL。

1.4 统计分析

每组试验重复3 次，采用SPSS Statistics 19.0软件进行方差分析；采用GraphPad Prim 8.0.2 绘制柱形图；使用Design-Expert 8.0.5 设计软件进行响应面分析；脂肪酸物质定性分析通过仪器自带的NIST 数据库检索，定量结果采用面积归一化法计算。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 二氯甲烷-甲醇体积比对小米油脂得率d的影响

如图1 所示，当二氯甲烷-甲醇体积比为1∶1时，小米油脂得率最大为3.58%。二氯甲烷含量过高或过低，都会使小米油脂得率降低。基于相似相溶原理，极性相近的物质易相互溶解，可推测小米所含油脂的极性与体积比为1∶1 的二氯甲烷-甲醇混合液的极性接近。

图1 二氯甲烷-甲醇体积比对小米油脂得率的影响Fig.1 Influence of dichloromethane-methanol volume ratio on yield of millet oil

2.1.2 萃取温度对小米油脂得率的影响

如图2 所示，在温度为130 ℃时，小米油脂的得率最高为4.48%。随温度的升高，小米油脂得率呈升高趋势。说明随温度的升高，小米油脂在有机溶剂中的溶解度会升高；当温度高于130 ℃时，小米油脂得率反而下降。这可能是因为低温减缓了脂肪溶出的速度，随温度的升高，分子运动加快，样品中的脂肪才易被提取，但是过高的温度会使油脂降解，这就导致了油脂得率下降。

图2 萃取温度对小米油脂得率的影响Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of millet oil

2.1.3 萃取时间对小米油脂提取的影响

如图3 所示，在12 min 时，所提取的小米油脂含量最高为4.13%，低于12 min 时，随时间的延长，油脂得率升高；超过12 min 后，小米油脂萃取率降低。小米脂肪需经过一定时间后才能被完全提取，所以油脂得率与时间成正比，但小米粉长时间暴露于高温高压的环境下会使其油脂降解，因此导致油脂得率下降。

图3 萃取时间对小米油脂得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of millet oil

2.1.4 循环次数对小米油脂提取的影响

如图4 所示，萃取循环次数为3 时，获得最大提取量4.12%，循环1～2 次所获得的小米油脂较少，可能是因为没有把小米中的油脂尽数提出。循环次数大于3 次时并没有提高小米油脂得率。

图4 循环次数对小米油脂得率的影响Fig.4 Influence of number of cycles on yield of millet oil

2.2 响应面试验结果

以小米油脂得率作为响应值，在单因素试验结果的基础上，用Design Expert 8.0.6.1 软件中的BoxBehnken 模型，进行3 因素（萃取温度、萃取时间、循环次数）3 水平（-1、0、1）的响应面试验设计，因素水平表见表3，结果见表4。表3 中的试验数据进行多项式回归拟合，得到回归方程：Y=4.52+0.035A-0.075B+0.039C-0.028AB-0.022AC+7.547E-0.03BC-0.19A2-0.25B2-0.14C2

表3 响应面试验设计各因素水平Table 3 Levels of each factor in response surface test design

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Response surface test design and results

式中Y 为小米油脂得率（%），A 为萃取时间（min），B 为萃取温度（℃），C 为循环次数。由表5的方差分析结果可知，回归模型P＜0.001，失拟项P＞0.05，说明该模型拟合度较高。决定系数R2=0.997 7，校正系数R2Adj=0.994 8，说明该模型与实际拟合较好。因此，该模型可用于小米油脂得率的分析与计算。A、B、C、AB、A2、B2、C2对小米油脂得率的影响均为极显著（P＜0.01）；AC 对小米油脂得率的影响显著（P＜0.05）；BC 对小米油脂得率的影响不显著（P＞0.05）。根据F值的大小，判定3 个因素对小米油脂得率的影响程度依次为：B（萃取温度）＞C（循环次数）＞A（萃取时间）。

表5 回归方程方差分析表Table 5 Regression equation variance analysis table

萃取时间、温度以及循环次数两两交互作用对小米油脂得率影响的响应面3D 图和等高线图如图5～图7 所示。随萃取时间的延长，小米油脂得率先升高后小幅度下降；随萃取温度的升高，小米油脂得率先升高后呈下降趋势，由其等高线图可看出，沿萃取时间轴等高线较萃取温度轴等高线稀疏，说明萃取时间对小米油脂得率的影响不如萃取温度的影响显著，等高线的形状可以体现交互作用的强弱，越接近椭圆交互作用越显著［10］，图中等高线呈椭圆形，说明萃取时间（A）与萃取温度（B）的交互作用显著。随萃取时间的延长和循环次数增加，小米油脂得率逐渐升高后小幅度下降，由其等高线图可看出，沿萃取时间轴等高线较循环次数轴等高线稀疏，说明循环次数对小米油脂得率的影响较萃取时间对其的影响显著，等高线呈椭圆形，说明萃取时间（A）与循环次数（C）的交互作用显著。随萃取温度的升高，小米油脂得率先升高后下降，随循环次数的增加，小米油脂得率变化不是很大，由其等高线图可看出，沿萃取温度轴等高线较循环次数轴等高线密集，说明萃取温度对小米油脂得率的影响较循环次数对其的影响显著，等高线呈圆形，说明萃取温度（B）与循环次数（C）的交互作用不显著。综上，萃取时间（A）与萃取温度（B）的交互作用极显著，萃取时间（A）与循环次数（C）的交互作用显著，萃取温度（B）与循环次数（C）的交互作用不显著，影响小米油脂得率因素的主次顺序为萃取温度（B）＞循环次数（C）＞萃取时间（A），与方差分析结果一致。响应面最高点在模型设计范围之内，说明此响应面变量设计较好，可用于后续分析。

图5 萃取温度和萃取时间对小米油脂得率影响的响应面（左）和等高线（右）Fig.5 Response surface（left）and contour（right）of effects of extraction temperature and time on yield of millet oil

图7 循环次数和萃取温度对小米油脂得率影响的响应面（左）和等高线（右）Fig.7 Response surface（left）and contour line（right）of influence of number of cycles and extraction temperature on yield of millet oil

对上述回归方程求解，得到小米油脂得率达到最大值时的提取条件为：时间12.20 min，温度128.45 ℃，循环次数3.12 次，小米油脂得率达4.527 74%。采用软件预测的最佳条件进行试验验证，得到实际小米油脂得率为4.53%，非常接近预测值，表明利用响应面法优化小米油脂的提取工艺具有可行性。

2.3 小米脂肪酸的GC-MS 分析结果

将小米油脂的甲酯化产物，经GC-MS 分析所得脂肪酸的气相色谱-质谱色谱图及相对含量，分别见图8、表6。

表6 小米油脂脂肪酸组成Table 6 Fatty acid composition of millet oil

图8 小米油脂肪酸组成的气-质色谱图Fig.8 The GC-MS spectrogram of millet oil fatty acid

图6 循环次数和萃取时间对小米油脂得率影响的响应面（左）和等高线（右）Fig.6 Response surface（left）and contour line（right）of effects of cycles and extraction time on yield of millet oil

小米中一共鉴定出了16 种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸有7 种，包括3 种单不饱和脂肪酸（12.04%）和4 种多不饱和脂肪酸（73.54%），n-6与n-3 的比值为22∶1；饱和脂肪酸有9 种，相对含量为14.42%。根据每个脂肪酸的相对含量可知，小米中的主要脂肪酸为：亚油酸、油酸、棕榈酸、硬酯酸、α-亚麻酸、花生酸和山萮酸，其中亚油酸含量最高，占脂肪酸总量的70.38%。

3 讨论

由于ASE 法具有仪器简单、精密度好、节约溶剂、萃取效率高、安全性好、操作方便等突出特点，目前已被广泛应用于各个领域。唐晓伟等［11］采用ASE 分析5 种蔬菜种子的含油量，结果表明西瓜种子的含油量最高，辣椒种子的含油量最低；刘有添等［12］比较了3 种方法对乌贼膏脂肪酸的提取效率，结果表明加速溶剂萃取法的提取效率最高，且节约溶剂和时间；周连宁等［13］研究萃取温度和时间对小球藻油脂得率的影响，结果表明油脂得率随萃取温度、时间的升高呈先上升后下降的趋势。ASE 法还应用于黄酮类化合物、人参皂苷、农药等的分离提取，ASE 法比常规萃取法的速度更快、萃取率更高［14-16］。崔素萍等［17］分析经索氏提取以及超声波辅助提取的6 种小米脂肪的脂肪酸组成，先通过超声波辅助提取小米脂肪30 min，后进行索氏抽提2 次，而加速溶剂萃取法，只需12 min 就可得到与其得率相当的小米油脂。提取脂肪常用的索氏提取法，虽然应用较多，但该方法不仅需要耗费大量的溶剂和时间，且油脂提取率低，说明ASE法可以节约小米油脂提的溶剂和时间。张义茹等［18］研究晋谷21 小米的脂肪酸组成，结果显示该小米中主要含有油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬酯酸、花生酸和山萮酸，其中，亚油酸所占的比例最高与本研究结果一致，研究表明亚油酸可以促进新陈代谢，预防动脉硬化［19］。因此，小米油是一种营养健康的油脂；霍权恭［20］等发现其研究的6 种小米的不饱和脂肪酸含量为不饱和脂肪酸总量82.02%～90.39%，本文研究得到小米不饱和脂肪酸含量介于此区间内为85.58%；李良玉等［21］研究微波处理对小米油的脂肪酸组成的影响，结果表明微波处理会使小米油中不饱和脂肪酸含量显著下降，而加速溶剂萃取法并未对其不饱和脂肪酸含量有显著影响。

本研究通过加速溶剂萃取法提取小米中的油脂，采用与氯仿性质相似但毒性较小的二氯己烷、甲醇混合溶剂作为提取剂［22］，与传统的油脂提取方法相比，不仅提高了油脂得率，大大节约萃取时间和萃取溶剂，且对小米油的脂肪酸组成没有显著影响，操作简单极大地提高了工作效率，显示出了ASE 法的优越性，表明用加速溶剂法提取小米油脂具有可行性。

4 结论

本研究分析了加速溶剂萃取法提取小米油脂的最优工艺以及小米油脂的脂肪酸组成。结果表明，小米油脂模型预测的最佳组合为：二氯甲烷-甲醇体积比1∶1，萃取时间12.20 min，萃取温度128.45 ℃，循环次数3.13 次，预测的最大得率为4.527 74%，实际结果为4.53%。小米油脂中含有的亚油酸、油酸、棕榈酸、硬酯酸、α-亚麻酸、花生酸和山萮酸等7 种脂肪酸，其中亚油酸含量最高为70.38%。该研究可为今后小米油脂的提取及加工利用等提供参考。