τ蛋白、β淀粉样蛋白、视锥蛋白样蛋白-1与阿尔茨海默病病人认知功能障碍的相关性研究

穆斌，李艳丽，王杰，胡金雅，孙志华

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性认知功能障碍和行为障碍为主的中枢神经系统退行性病变［1］。在我国65 岁以上的老年人中，AD 的患病率为3%左右［2］。AD 起病隐匿，早期症状较轻且难以发现。在中晚期，进行性智力下降，生活能力丧失，药物干预效果差，其早期诊断意义重大［3］。研究表明，AD 可能与许多影响因素有关，如神经炎症反应、遗传易感性、基因突变、代谢紊乱等［4］。轻度认知功能损害（mild cognitive impairment，MCI）是指认知功能轻度进行性改变或损害，这是痴呆前阶段，随着时间的流逝和疾病的发展，症状将逐渐恶化［5］。钙离子（Ca2+）是重要的第二信使，参与各种生理和病理生理过程。视锥蛋白样蛋白-1（trypsin-like protein-1，VILIP-1）可以通过影响神经元细胞的Ca2+稳态来反映神经元损伤，这可能是AD 潜在的体液生物学标志。随着研究的逐渐深入，发现β 淀粉样蛋白（βamyloid protein，β-AP）和τ 蛋白在AD 的发生和发展中起着主导作用［6-7］。国内外文献报道主要集中于AD 病人脑脊液中β 淀粉样蛋白和τ 蛋白水平的研究，尽管脑脊液中蛋白质的检测更加准确和特异性，并且血清标本的特异性不如脑脊液中的蛋白质，但是从脑脊液中获取材料更加困难，并且存在一定的风险［8］。血清标本的收集方便，快捷，易于接受且高度安全，这使得检测血清中的生物标志特别重要［9］。目前尚无明确统一的诊断AD 的血清学标志物，本研究将联合检测τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 水平，探讨其与老年AD 病人认知功能障碍的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料前瞻性选取2020 年1—7 月在河北中石油中心医院治疗的老年AD 病人100 例（AD组），其中男性58 例，女性42 例；年龄（75.50±4.30）岁，范围为65～81 岁；体质量指数（22.01±2.11）kg/m2，范围为19.70～24.33 kg/m2；学历程度：小学55例，初中或高中38 例，大学及以上7 例；同时选取该院体检健康者50 例作为对照组，其中男性32 例，女性18 例；年龄（74.70±4.55）岁，范围为65～83 岁；体质量指数（21.94±2.08）kg/m2，范围为19.60～24.20 kg/m2；学历程度：小学28 例，初中或高中19 例，大学及以上3 例。AD 组和对照组受试者性别、年龄、体质量指数、学历程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①年龄≥65 岁；②诊断符合美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会诊断中的标准［10］；③初治病人；④病人及近亲属知情同意。排除标准：①有其他导致认知功能障碍的疾病；②有颅脑创伤、手术史；③近期有利尿剂、卡马西平等药物服用史；④有药物成瘾性者。本研究获得河北中石油中心医院伦理委员会批准（KYLL-2020-14）。

1.2 观察指标及测评方法（1）血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 水平。早晨7∶00 至8∶00 在空腹中摄取3 mL肘静脉血，并将其放入装有柠檬酸钠的抗凝真空管中。以3 500 r/min（离心半径13.5 cm）的速度离心10 min，留取上清液置于-80 ℃的超低温冰箱中保存。酶联免疫吸附测定（ELISA）检测β-AP，τ 蛋白和VILIP-1 水平。将收集到的血清标本加入到样品孔中，按要求设置空白组与对照组，加入后，在37 ℃下孵育半个小时，除了空白孔外，向其余各孔加入酶标记的试剂，重复孵育和洗涤，添加显色剂，然后在黑暗中于37 ℃显色15 min后添加终止溶液。在450 nm 波长处处使用352 型酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS 公司）测量每个孔的吸光度值。绘制标准曲线，将测得的每个孔的吸光度代入公式，求得样品浓度。（2）采用简明精神状态量表（MMSE）评估病人认知功能［11］，该量表评估内容包括定向力、注意力和计算力、记忆力，回忆能力、语言能力等方面，总分30分，分数越低，则认知功能受损越严重，其中大学及以上＜23 分，初中或高中＜22分，小学＜20分判断为认知障碍。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计。符合正态分布计量资料采用± s表示，组间比较使用两独立样本t 检验；计数资料采用频数或百分比表示，组间比较使用χ2检验；相关性采用Pearson 相关性分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 比较AD 组组血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比较/± s

表1 两组血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比较/± s

注：β-AP 为β 淀粉样蛋白，VILIP-1 为视锥蛋白样蛋白-1，AD 为阿尔茨海默病。

组别对照组AD组t值P值例数50 100 τ蛋白/（pg/L）19.01±5.03 24.40±5.55 5.78＜0.001 β-AP/（ng/L）130.32±32.15 210.22±44.43 12.57＜0.001 VILIP-1/（ng/L）3.02±0.95 8.11±1.82 22.50＜0.001

2.2 AD 病人中两亚组一般资料分析100 例AD病人中，有47 例痴呆（痴呆亚组），53 例MCI 病人（MCI 亚组）。两组病人性别、年龄、体质量指数、学历程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；AD 痴呆病人MMSE评分低于MCI病人（P＜0.05）。见表2。

2.3 AD 病人中两亚组血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1比较AD 痴呆病人血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1 高于MCI病人（P＜0.05），见表3。

2.4 相关性分析经Pearson 相关性分析，血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1 与MMSE 评分呈负相关（r=-0.54、-0.33、-0.51，P＜0.05），可见随AD 病人认知功能障碍加重，血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1水平明显升高。

表2 阿尔茨海默病两亚组病人一般资料比较

表3 阿尔茨海默病两亚组病人血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比较/± s

表3 阿尔茨海默病两亚组病人血清τ蛋白、β-AP、VILIP-1比较/± s

注：β-AP为β淀粉样蛋白，VILIP-1为视锥蛋白样蛋白-1，MCI为轻度认知功能损害。

组别MCI痴呆t值P值例数53 47 τ蛋白/（pg/L）21.37±4.10 27.82±3.82 8.11＜0.001 β-AP/（ng/L）183.47±44.19 240.38±37.32 6.91＜0.001 VILIP-1/（ng/L）6.43±1.44 10.01±1.90 10.69＜0.001

3 讨论

MCI 是AD 的早期阶段，这是介于正常人与AD痴呆之间的认知障碍。目前有很多关于AD 病人脑脊液中β-AP 和τ 蛋白的定量研究，目前国内外对于认知障碍的研究样本来源多集中于脑脊液方向，在血液生物学指标的研究上开展相对较少［12-13］，而血液学指标获取相对便捷，更具有研究价值。

τ 蛋白过度磷酸化可使神经原纤维缠结，引发神经元结构及功能发生改变［14］。β-AP 会加剧机体内氧化应激反应程度，导致神经细胞功能紊乱，导致神经细胞凋亡与突触的大量丢失，因而影响神经功能［15-16］。研究结果表明，AD 痴呆病人血清τ 蛋白显著较对照组高。分析原因是τ蛋白的过度磷酸化参与了AD 的发作。τ 蛋白能够调节微管蛋白向微管聚合的速度和程度，减少微管的崩解，维持微管的结构和功能的稳定性以及参与神经轴突中营养的运输。磷酸化的水平决定了τ 蛋白的生物学功能。由于各种原因，τ 蛋白过度表达，被释放进入血液循环，降低微管的稳定性和生物活性。最终导致信号传递障碍，轴突运输障碍，突触功能退化，导致神经元死亡或凋亡。病人出现了一定程度的认知障碍，患有认知功能减退的AD 病人痴呆病人血清中τ蛋白高于MCI病人。

在正常生理条件下，人脑组织仅少量表达β-AP，但在某些病理条件下，β-AP 的清除过程受到阻碍，导致其沉积，随之进入血液循环，大量β-AP可损伤神经，导致微循环障碍，使老年病人神经元变性和死亡，引发认知功能障碍［17］。研究表明，β-AP 的大量释放会影响磷脂酰醇3激酶的活性引起认知障碍。在这项研究中，AD 痴呆病人血清β-AP 高于对照组，AD痴呆病人血清β-AP高于MCI病人。

AD 的发生是许多因素的结果，AD 作为一种神经退行性疾病，以进行性记忆障碍和认知能力下降为早期表现。MMSE 量表具有良好的信度和效度，目前被认为是衡量认知功能的良好量表之一。国内外许多有关老年人认知功能和痴呆的研究都采用这种量表［18］。本研究结果显示，AD 痴呆病人MMSE 评分低于MCI 病人。血清τ 蛋白、β-AP 与MMSE评分呈负相关，可作为预测AD病人发生认知功能障碍的参考指标。

在AD 的发病机制中，存在Ca2+稳态和Ca2+信号异常［19］。Ca2+是中枢神经系统中重要的第二信使，中枢神经系统内外的信号转导与Ca2+密切相关，Ca2+参与神经递质传输、神经元之间的信号转导等［20］。从功能上讲，钙调蛋白结合肽（CBP）可以分为两类：钙缓冲蛋白和神经元钙传感器（NCS）。前者包括白蛋白和钙结合蛋白，其中VILIP-1 被包括在NCS 中。VILIP-1 的构象在与Ca2+结合后发生改变，并且与细胞器或靶蛋白的细胞膜相互作用，以影响细胞信号的传递［21］。目前的研究结果表明，NCS 与AD 的病理生理过程有关，并且在中枢神经系统突触之间的神经递质的传递、细胞内外信息的传递、细胞代谢、基因表达等方面起作用。研究发现，VILIP-1在皮质的锥体和非锥体细胞中广泛表达。VILIP-1 的mRNA 广泛分布在大脑中，它分布在除尾状核以外的几乎大脑的每个区域，并在海马锥体细胞和粒状细胞的树突中表达，表明其树突功能起特定作用。由于VILIP-1 在皮质和海马中表达，因此由Ca2+介导的神经毒性在AD 的病理生理过程中起着至关重要的作用。但目前尚未有关于VILIP-1 与AD 病人认知功能之间的关系研究。

本研究检测了AD 病人的血清VILIP-1 水平，结果显示，AD 组的血清VIILIP-1高于对照组，AD 痴呆病人血清VILIP-1高于MCI病人。分析原因是：VILIP-1 通过影响人体的Ca2+稳态来促进神经元损伤，它参与调节神经元细胞中Ca2+途径可能与突触可塑性有关。通过增强Ca2+对环腺苷酸的作用，VILIP-1会影响环核苷酸级联反应、烟碱信号传递并增加G蛋白的敏感性。此外，VILIP-1可以促进神经元死亡和异常磷酸化。VILIP-1 在被Ca2+激活后可以与肌动蛋白和mRNA 结合，这意味着VILIP-1 在亚细胞水平上参与了mRNA 的调节。同时，通过调节突触前和突触后的相关信息，VILIP-1受体的磷酸化与记忆的形成有关。从病理生理学的角度来看，VILIP-1可以作为AD 的新的潜在血液学生物学标志。血清VILIP-1 与MMSE 得分呈负相关。AD 病人的VILIP-1 水平升高，VILIP-1 通过影响神经元细胞的钙稳态来促进神经元变性和坏死，从而使细胞内VILIP-1释放到血液中。血液中VIPLP-1 的水平升高，病人的认知功能受损。目前，未见有关于VILIP-1 与AD中τ 蛋白、β-AP 之间具体关联的研究，考虑三者在一定程度上互相协同，共同参与了AD 的发生发展，关于这方面的研究将是今后的研究方向。VILIP-1可用作诊断AD 和病人认知功能障碍严重程度的标志物，监测疾病的发展和药物治疗的效果。而且，血样具有采集方便，无创，可行性强，安全性好，协调性好等优点，在临床上具有广阔的应用前景。

故本研究首次将Tau 蛋白、Aβ 和VILIP-1 与老年AD 病人认知功能障碍的关系进行分析，通过早期相关血清Tau 蛋白、Aβ 和VILIP-1 来对病人认知功能变化情况进行反映，具有明显的创新性，不仅检测效果良好，且样品易于获取，且为无创性，而且可以重复检测，能被病人广泛接受。

综上所述，AD 病人血清τ 蛋白、β-AP、VILIP-1水平升高，与病人认知功能障碍呈负相关性，可能在病人认知功能判断中有一定应用价值。