丹皮酚对急性胰腺炎小鼠的保护效果

尹 星，范露露，金圣奇，姜凯腾，范嘉杰，张 鹏

(沈阳工学院生命工程学院，辽宁 抚顺 113122)

胰腺周围脂肪组织和腺泡坏死被认为是急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)的主要病理特征[1]。近年来临床调查发现，AP发病率居高不下，然而，经过大量的试验和临床研究，仍未发现一种治疗该病的特效药物。因此，AP靶向药物的研发一直备受医药界关注。丹皮酚是从牡丹根皮中分离得到的主要成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、镇痛等作用[2]，临床上多用于治疗结肠炎、缺血再灌注损伤、牙周炎等。AP会引起胰腺腺泡细胞内钙离子浓度持续升高，导致血清钙离子含量逐渐下降[3]，同时大量腺泡细胞破坏，阻塞胰管，使其内的各种消化酶无法进入十二指肠，从而反流入血，使得血清中脂肪酶和淀粉酶的含量显著增多[4]。故本试验采用L-精氨酸诱导AP小鼠模型，通过检测血清中淀粉酶和钙离子含量以及血浆中各炎症指标来评价丹皮酚对AP小鼠的保护作用，以期为相关兽药研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明系雄性SPF级小鼠50只，体重18～22 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK(辽)2020—0001。

1.2 主要试剂 丹皮酚和L-精氨酸，均购自大连美仑生物技术有限公司；血清淀粉酶检测试剂盒(C016-1-1)和钙离子检测试剂盒(C004-1-1)，均购自南京建成生物科技有限公司；苏木精-伊红(H.E.)染液,购自塞维尔生物技术有限公司；其他试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验分组与设计 将小鼠随机分成5个组，即空白对照组、模型组和不同剂量丹皮酚组。不同剂量丹皮酚组每组灌胃剂量分别为25、50 mg/(kg·bw)和100 mg/(kg·bw)，灌胃量均为0.5 mL，同时空白对照组和模型组给予等体积生理盐水，连续灌胃5 d。在最后1次灌胃给药1 h后，采用20 %L-精氨酸腹腔注射模型组和不同剂量丹皮酚组小鼠，给药剂量为4 g/(kg·bw)，6 h后进行眼球采血，随机取各组6只小鼠的血浆，一部分用于血常规检测；另一部分低温离心10 min分离血清，用于血清淀粉酶和钙离子含量的测定；随机取各组4只小鼠的胰腺，用于病理切片及苏木精-伊红(H.E.)染色。

1.4 观察指标

1.4.1 胰腺组织病理切片及H.E.染色 取各组小鼠的胰腺组织浸入到10%甲醛溶液中固定48 h，通过石蜡切片制作、H.E.染色和脱水封片后在显微镜下观察各组胰腺组织的病理学特点，进行图片采集分析。

1.4.2 胰腺病理组织评分 在Schmidt评分标准[5]的基础上进行改良，并参照Pozsar等[6]的方法对胰腺水肿、炎症、出血和坏死进行计分，评分标准见表1，每张切片随机计数4个视野，取平均分代表其损伤程度。

表1 胰腺组织学评分标准

1.4.3 血清淀粉酶活性测定 采取淀粉-碘比色法测定各组小鼠血清中淀粉酶活性，按照血清淀粉酶试剂盒说明书进行测定。

1.4.4 钙离子含量测定 采取甲基百里香酚蓝比色法测定各组小鼠血清钙离子的含量，按照钙离子试剂盒说明书进行测定。

1.4.5 血常规检测 使用爱德士干式血细胞分析仪(VetAutoread)检测血常规指标：白细胞数量、颗粒性白细胞数量、纤维蛋白原含量。

1.5 试验数据统计与分析 所有数据需要进行统计学分析，使用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行一维方差分析，经过分析之后的各组试验数据结果均列入表格中。

2 结果

2.1 小鼠状态检查 给予20%L-精氨酸后对各组小鼠进行观察，空白对照组小鼠无异常表现。模型组小鼠在给药10 min后出现精神沉郁、步态不稳、不喜运动等临床表现，个别小鼠还有呼吸加深、加快等现象。不同剂量丹皮酚组小鼠均出现不同程度精神恍惚、不喜运动现象。其中25 mg/(kg·bw)组和50 mg/(kg·bw)组小鼠在给药2 h后出现聚集成堆、食欲减退现象；100 mg/(kg·bw)组小鼠在给药4 h后精神状态轻度沉郁、群聚。

2.2 胰腺组织病理形态学观察 结果如图1所示，空白对照组小鼠的胰腺组织形态正常，未见病理学变化(图1A)；模型组小鼠胰腺组织出现崩解，腺泡细胞空泡化，局部有充血并伴有淋巴细胞、单核细胞浸润(图1B箭头)；不同剂量丹皮酚组小鼠胰腺组织腺泡呈不同程度空泡化及单核细胞浸润，其中25 mg/(kg·bw)组较为严重；25 mg/(kg·bw)组和50 mg/(kg·bw)组小鼠胰腺组织可见充血、腺泡细胞崩解和组织间隙增大(图1C、1D)；100 mg/(kg·bw)组胰腺病理变化较模型组明显改善(图1E)。

图1 小鼠胰腺组织病理形态学观察 (H.E.染色，400×)

2.3 胰腺病理组织评分 结果如表2所示，空白对照组与模型组小鼠胰腺组织病理学评分差异极显著(P<0.01)，结合图1说明小鼠AP模型构建成功。不同剂量丹皮酚组小鼠胰腺组织病理学评分之间有一定的量效关系，即随丹皮酚剂量的加大胰腺组织病理学评分逐渐降低，且50 mg/(kg·bw)组和100 mg/(kg·bw)组与模型组相比，具有极显著性差异(P<0.01)，说明丹皮酚对AP小鼠有一定的保护效果。

2.4 丹皮酚对AP小鼠血清淀粉酶活性的影响 结果如表2所示，模型组血清淀粉酶活性较空白对照组极显著升高(P<0.01)，说明小鼠AP模型构建成功。不同剂量丹皮酚组血清淀粉酶活性较模型组均极显著降低(P<0.01)，且呈剂量依赖性，即随剂量的加大血清淀粉酶活性逐渐降低，说明不同剂量丹皮酚能够极显著地降低AP小鼠血清淀粉酶含量。

2.5 丹皮酚对AP小鼠血清钙离子含量的影响 结果如表2所示，模型组血清钙离子含量较空白对照组极显著降低(P<0.01)，说明小鼠AP模型构建成功。不同剂量丹皮酚组血清钙离子含量较模型组均极显著升高(P<0.01)，且呈剂量依赖性，即随丹皮酚剂量的加大血清钙离子含量逐渐升高，说明不同剂量丹皮酚能够极显著地恢复AP小鼠血清钙离子含量。

表2 丹皮酚对AP小鼠病理损伤及生化指标的影响

2.6 丹皮酚对AP小鼠血浆中炎症指标的影响 结果如表3所示，模型组小鼠血浆中白细胞数量、颗粒性白细胞数量、纤维蛋白原含量较空白对照组均极显著上调(P<0.01)，说明模型组小鼠发生严重的炎症反应，符合AP模型临床症状。不同剂量丹皮酚组白细胞数量、颗粒性白细胞数量、纤维蛋白原含量与模型组相比均极显著下调(P<0.01)，且呈剂量依赖性，即随丹皮酚剂量的加大各炎症指标呈不同程度降低，说明不同剂量丹皮酚能够极显著地降低AP小鼠各种炎症指标。

表3 丹皮酚对AP小鼠血浆中炎症指标的影响

3 讨论

AP是一种常见的炎症性疾病，临床上对其发病原因及发病机制尚不明确，且有效治疗AP的药物屈指可数。尽管研究发现抗分泌药物、抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、血小板活化因子抑制剂和抗炎免疫调节剂可以缓解AP的严重程度，但这些药物在临床应用仍有局限性[7]。因此，许多学者将治疗AP药物的研究指向传统中药，希望从中寻求一味替代性药物。国内外研究发现，丹皮酚具有良好的镇痛抗炎作用。Wang等[8]研究发现，丹皮酚通过抑制小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，缓解急性肺炎的临床症状。此外用丹皮酚灌肠给药也可以有效治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎[9]。因此本试验利用小鼠AP模型考察丹皮酚的抗炎效果，为临床抗炎药物的研发提供理论依据。

血清淀粉酶和钙离子是临床诊断胰腺炎的重要指标，本试验通过考察丹皮酚对AP小鼠保护效果时发现，不同剂量丹皮酚均能显著降低AP小鼠淀粉酶含量并纠正低血钙水平。此外，也有学者证明，槲皮素[10]、丹参[11]、大黄素[12]和黄芩素[13]等中药单体也具有相似的效果。近年来有学者证明，丹皮酚注射液对AP大鼠模型也有一定的保护作用，且不同剂量组对大鼠胰腺组织病理学评分之间有一定的量效关系，即随丹皮酚剂量的加大胰腺组织病理学评分逐渐降低，同时缓解了大鼠胰腺的病变程度[14]，与本试验结果一致。纤维蛋白原是由肝细胞合成和分泌的一种糖蛋白，在血浆中主要参与凝血和止血过程，是反映机体炎症反应中最敏感的蛋白指标[15]，因此，本试验引入纤维蛋白原作为检测AP严重程度的重要指标，以期为预防和治疗AP提供新思路。

综上所述，本试验表明丹皮酚对AP小鼠具有显著的保护效果。本试验结论为后期临床预防和治疗动物AP提供替代性药物选择，同时也为促进动物福利与社会和谐健康发展带来巨大的社会与经济价值。