褪黑素对H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用

刘合栋 任茂贤 李杨 蒋文凯 周志 杨民

皖南医学院第一附属医院/弋矶山医院创伤骨科，安徽 芜湖 241001

随着社会人口老龄化的不断发展，骨质疏松症发病率日益升高[1]。研究[2]表明，氧化应激在骨质疏松症发病中占有重要地位。活性氧主要由线粒体产生，过量的活性氧在降低成骨细胞功能的同时可以激活破骨细胞，导致骨重建失衡从而引起骨质疏松。此外，活性氧增加可导致线粒体膜电位降低，引起细胞凋亡[3]。因此，保护成骨细胞免受氧化应激损伤对于预防骨质疏松症具有重要意义。

褪黑素是一种由松果体分泌、受下丘脑调节的无毒性吲哚胺，主要调节昼夜节律，同时具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功能[4]。有研究[5]表明，在非肿瘤细胞中褪黑素通过激活SIRT1发挥作用，而SIRT1的作用靶点之一是p66SHC，SIRT1上调可以降低p66SHC的表达[6]。同时，p66SHC可以将氧化信号转变成活性氧，并促进线粒体氧化信号转变成凋亡信号[7]。由此推测褪黑素可能通过调节SIRT1/p66SHC信号通路来抑制氧化应激引起的成骨细胞的凋亡。因此，本研究拟使用体外H2O2诱导成骨细胞氧化应激损伤模型来探讨褪黑素对成骨细胞氧化应激损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗均购于美国Gibco公司；褪黑素(melatonin，MT)、CCK8试剂、BCIP/NBT碱性磷酸脂酶显色试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、0.2 %茜素红、十六烷基吡啶均购于索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；凋亡检测试剂盒购买于贝博生物科技有限公司；抗体SIRT1、p66SHC、Bax、Bcl2、BMP2、RUNX2、β-actin购买于Affinity公司；手术器械由皖南医学院弋矶山医院创伤骨科提供。矿化诱导培养基由F12-DMEM完全培养基加入10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C配置而成。

1.2 实验方法

1.2.1成骨细胞的分离、纯化及鉴定：取24 h内新生SD大鼠乳鼠浸泡于75 %乙醇中20 min，移入无菌操作台，使用眼科剪和眼科镊分离颅骨，刮去骨膜及骨缝间结缔组织并用含双抗的PBS冲洗，直至骨块变白。将骨块剪成1 mm×1 mm大小骨片，加入5 mL 0.25 %胰酶消化10 min，弃胰酶，加入5 mL 0.5 % I型胶原酶震荡消化20 min，弃消化液后再次加入5 mL 0.5 % I型胶原酶在37 ℃恒温下消化90 min。消化完毕后用等量含血清的F12-DMEM培养基终止消化，无菌筛网过滤，将碎骨片接种于T25培养瓶中倒置培养，4 h后正置培养瓶。成骨细胞经矿化诱导培养基培养7 d、21 d后，按照试剂盒说明书分别进行ALP和茜素红染色，以鉴定原代成骨细胞是否提取成功。

1.2.2氧化应激模型的建立：将第三代成骨细胞按5×103/孔接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后更换成含100、200、400、800 μmol/L H2O2的培养基继续培养2、3、4、5、6 h，结束后每孔加入10 μL CCK8 试剂并孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度。依据说明书计算细胞存活率。

1.2.3氧化应激指标检测：将第三代成骨细胞以1×106/孔接种于6孔板中，将细胞分为四组：对照组、H2O2组(400 μmol/L H2O2作用4 h)、MT组(100 μmol/L褪黑素预处理24 h然后用400 μmol/L H2O2作用4 h)、EX527组(MT预处理前用10 μmol/L EX527预处理2 h)。结束后收集细胞，按照试剂盒说明书测定SOD活性及MDA含量，同时将四组细胞孵育DCFH-DA探针，荧光显微镜记录四组细胞图像并测定ROS荧光强度。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡：细胞经不同干预措施处理后，使用凋亡检测试剂盒对细胞进行FITC和PI染色，结束后经流式细胞仪上机检测各组细胞凋亡率。

1.2.5ALP及茜素红染色：细胞经不同干预措施干预7 d、21 d后，按照试剂盒说明书分别行ALP及茜素红染色。同时，用ALP活性检测试剂盒检测各组细胞ALP活性，用十六烷基吡啶溶解钙结节，用酶标仪测定570 nm处吸光度。

1.2.6Western Blot检测蛋白水平：用RIPA裂解液收集各组细胞，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度并计算30 μg蛋白所需上样量。样本经SDS-PAGE凝胶电泳分离不同分子量蛋白质，然后转膜。转膜结束后用5 %BSA封闭2 h，然后将膜置于含有SIRT1(1∶1 000)、p66SHC(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、BMP2(1∶1 000)、RUNX2(1∶1 000)、β-actin(1∶500)的抗体盒中，4 ℃摇床孵育过夜。次日将膜用TBST洗净并放入对应二抗中孵育2 h。孵育完成后用TBST洗净并用ECL发光液显影，使用Image J测定灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成骨细胞的提取与鉴定

如图1所示，骨块贴壁3 d后，倒置显微镜下可见骨块蓬松，细胞零星的从骨块边缘爬出，呈饱满长梭形(图1B)，7 d后铺满整个瓶底(图1C)。ALP染色显示细胞被染成蓝紫色(图1 D)，茜素红染色视野中可见数量不一、大小不等的橘红色圆形钙结节(图1E)，提示原代成骨细胞提取成功。

图1 原代成骨细胞的提取与鉴定

2.2 H2O2对成骨细胞增殖的影响及氧化应激指标的检测

如图2A所示，成骨细胞存活率随着H2O2浓度的升高和作用时间的延长而逐渐下降，在400 μmol/L浓度下作用4 h存活率为52 %，因此采用此浓度与时间建立氧化应激模型。经H2O2、褪黑素、EX527处理后，各组细胞ROS含量、SOD活性、MDA含量如图2B～图2E所示，结果表明H2O2处理后ROS升高，荧光显著增强，细胞肿胀变圆，SOD活性降低，MDA含量升高，表明H2O2处理后成骨细胞氧化应激水平升高。褪黑素处理缓解了H2O2对成骨细胞的氧化应激损伤，而EX527能够逆转褪黑素对H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用。

图2 H2O2对成骨细胞增殖的影响及氧化应激指标的检测

2.3 各组细胞ALP活性、矿化能力及凋亡的变化

细胞经H2O2、褪黑素、EX527处理后，成骨细胞ALP及茜素红染色结果如图3A、3B所示，定量分析结果如图3C、3D所示，凋亡率如图3E所示。结果表明H2O2诱导氧化应激后，成骨细胞ALP活性及矿化能力下降，凋亡率升高；褪黑素预处理能够缓解H2O2诱导的氧化应激损伤，使成骨细胞ALP活性及矿化功能增强，凋亡率降低；而EX527能够逆转褪黑素的上述功能。

图3 各处理因素对成骨细胞ALP活性、矿化能力及凋亡的影响

2.4 不同处理措施干预后对细胞蛋白表达的影响

细胞经不同处理措施干预后，蛋白表达如图4所示。结果表明，H2O2处理后成骨细胞BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1表达降低，Bax、p66SHC表达升高。褪黑素处理能够缓解上述蛋白表达的变化。而SIRT1抑制剂EX527能够逆转褪黑素的上述功能。

图4 各处理措施对成骨细胞蛋白表达的影响

3 讨论

骨重建由成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收来维持，当成骨细胞的骨形成不足以弥补破骨细胞的骨吸收时就会导致骨质疏松[8]。本研究中，成骨细胞经褪黑素预处理后与H2O2组比增强了ALP活性、矿化功能，降低了ROS、MDA含量，增强了SOD活性，减少了凋亡率，增加了BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1蛋白的表达，降低了Bax、p66SHC蛋白的表达，SIRT1抑制剂EX527能够逆转褪黑素的上述作用，表明褪黑素通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤并促进成骨。

H2O2作为ROS主要成分之一，由于具有相对稳定性和长时间不带电等特性被广泛用于诱导建立氧化应激损伤模型[9]。本研究显示，H2O2处理后成骨细胞活性降低，细胞肿胀变圆，ROS含量增加，表明细胞趋于凋亡。过量产生ROS将激活氧化应激并破坏脂质、核酸、蛋白质等生物大分子，引起脂质过氧化[10]。其产物通过调节NF-κB通路、MAPKs通路、PKC通路来诱导细胞发生凋亡[11]。同时，ROS的大量产生将消耗细胞内过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化物质，引起抗氧化酶活性降低。本研究结果显示，细胞经H2O2处理后ROS含量、MDA含量增加，SOD活性降低，细胞凋亡增加，表明H2O2处理成功诱导了成骨细胞的氧化应激损伤。

本研究中，褪黑素通过SIRT1/p66SHC通路抑制氧化应激并促进成骨，这与Chen等[12]的研究结果相似，其研究显示褪黑素通过上调SIRT1抑制氧化应激，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化从而促进成骨。Zhou等[13]研究表明褪黑素通过调节SIRT3/SOD2通路抑制线粒体氧化应激增加OVX大鼠假体周围骨量。最近研究[14]表明，褪黑素激活SIRT1/PGC1α/SIRT3通路保护异丙肾上腺素诱导的心肌细胞损伤，大脑p66SHC基因缺失的小鼠显示出SIRT3活性增强[15]。由此笔者推测褪黑素可能通过SIRT1/p66SHC轴调节SIRT3/SOD2轴发挥抗氧化应激功能。此外，体内研究[16]发现褪黑素MT1受体缺陷小鼠骨量正常，而MT2受体缺陷的小鼠表现出低骨量，表明褪黑素主要通过MT2受体调节骨量。褪黑素还能通过改善炎症因子的表达增加OVX大鼠的骨密度[17]。体外研究[18]表明褪黑素能够上调神经肽Y和神经肽Y受体的表达，促进骨髓间充质干细胞的增殖与迁移，从而促进骨折愈合。这些结果表明褪黑素能够通过受体介导和非受体依赖(抗氧化和抗炎作用)作用机制来预防骨降解，促进骨形成。

SIRT1是一种NAD+依赖的III类组蛋白脱乙酰酶，通过对组蛋白、转录因子等多种底物进行去乙酰化来调节细胞周期、炎症、凋亡、自噬等生物过程[19]。研究[6]表明，在内皮细胞中，SIRT1过表达能够使组蛋白H3发生去乙酰化，减少乙酰化组蛋白H3与p66SHC启动子的结合，从而降低p66SHC的转录。p66SHC是shcA基因家族中的一个亚型，在诱导细胞氧化应激和凋亡中发挥重要作用。当细胞感知氧化应激时，p66SHC从细胞质转移到线粒体并氧化细胞色素C，催化氧还原为H2O2，导致ROS升高[20]。升高的ROS触发线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，引起线粒体肿胀，线粒体外膜破裂，电子传递链蛋白复合体活性下降，并释放促凋亡因子引起细胞凋亡[21]。本研究中，褪黑素上调SIRT1的同时降低了p66SHC的表达，同时SOD活性增强，ROS含量、MDA含量降低，Bcl2表达升高而Bax表达降低；而SIRT1抑制剂EX527能够抑制褪黑素的上述作用。这些结果提示褪黑素通过SIRT1/p66SHC通路抑制H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤。

综上所述，褪黑素可能通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H2O2诱导的成骨细胞的氧化应激损伤并促进成骨。但本研究尚需进一步的动物实验来验证其机制。