冷暴露下酪氨酸联合半胱氨酸对小鼠脂质代谢的影响

刘鼎鑫，孟凡舜，李仕韦，董稼诗，吕红明，李鹏

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

寒冷气候下，哺乳动物主要通过两方面来维持体温恒定，减少散热（如血管收缩）和增加产热[1]。产热分为颤栗性产热和非颤栗性产热，二者相互合作，机体首先不自觉颤抖，骨骼肌反复收缩，消耗储存的糖原产生热量，当产生的热量不足以抵抗外界寒冷刺激时，机体会激活棕色脂肪组织等不以骨骼肌产热的非颤栗性产热来维持体温恒定[2]。非震颤性产热主要发生在棕色脂肪组织中，低温时，位于下丘脑上的冷热感受器受到刺激，促使交感神经兴奋，交感神经末梢会释放去甲肾上腺素，去甲肾上腺素（NE）通过作用于棕色脂肪细胞上的β3 肾上腺素受体，在棕色脂肪细胞中最终启动甘油三酯分解[2]成游离脂肪酸，棕色脂肪细胞中含有大量的脂肪酸结合蛋白，在胞浆中与脂肪酸结合，运送至线粒体，然后通脂肪酸过肉碱穿梭进入到线粒体内膜，通过β-ox 氧化代谢生成乙酰辅酶A 和NADH，后续产物参与到线粒体呼吸链中，脂肪酸还可以用于激活解偶联蛋白（UCP1）。

酪氨酸是合成去甲肾上腺素的前体物质，广泛存在于食物蛋白中，同时也能在机体中合成，属于非必需氨基酸[3]。长期暴露于冷环境下，会造成去甲肾上腺素的耗竭，补充酪氨酸可以减弱去甲肾上腺素衰弱所造成的影响[4]。半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20 多种氨基酸中唯一具有还原性巯基（-SH）的氨基酸，是还原型谷胱甘肽（GSH）的前体物[5]，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，广泛存在于动物组织细胞中。GSH 可参与机体多种重要的生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，保证能量代谢、细胞利用[6]。同时，其通过巯基与体内的自由基结合，可直接使自由基还原成酸性物质，从而加速自由基的代谢，并对抗自由基对重要脏器的损害[7]。

酪氨酸和半胱氨酸与多种激素生成有关，两者都可以在机体抵抗冷应激中发挥作用，试图通过在日粮中增加酪氨酸和半胱氨酸的摄食量，观察机体在冷环境下脂质代谢的变化。并初步探讨其中的产热机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

甘油三脂（TC）、总胆固醇（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）检测试剂盒购自南京建成公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、SDS-PAGE 制胶试剂盒、SDA-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X）购自上海碧云天公司；蛋白marker、底物发光液、PVDF 膜购自美国MILLIPORE 公司；UCP1 兔单克隆抗体、β-Tublin 兔多克隆抗体、HRP 标记的山羊抗兔IgG 购自美国Proteinch 公司。

1.2 实验动物

SPF 级C57 小鼠，雄性，3 周龄，体重14~16 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。分为室温对照组和4 °冷刺激组，冷刺激组又分为基础日粮组和3组不同浓度的氨基酸饲料组，每组8 只。昼夜12 h 交替光照，自由饮水，室温（27±2）°条件下饲养，一个月后进行脱颈处死。

1.3 实验饲料

半胱氨酸纯度99.66%，酪氨酸纯度＞98%，购自浙江一诺生物科技有限公司。分别在1Kg 鼠粮中添加20、60、100 g 的酪氨酸混合半胱氨酸（1∶1 混合），加工自沈阳前民饲料厂。

1.4 血液生化指标检测

小鼠禁食12 h，眼球采血1~2 mL，3 000 rpm·min-1离心10 min，提取血清。按试剂盒说明，血清TC 和TG 采用酶比色法进行测定；高密度脂蛋白和低密度脂蛋白采用清除法进行测定。

1.5 棕色脂肪组织的形态学分析

将各组小鼠肩胛脂肪组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片5 μm厚，苏木精-伊红（HE）染色，20 倍物镜下观察各组小鼠脂肪的形态。

1.6 UCP1 蛋白表达水平的检测

采用Western blot 法。3 周龄小鼠喂养4 周后，断颈处死，冰上分离肩胛脂肪组织。提取总蛋白后，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。配制10%SDS-page 胶进行电泳，每个样本上样量为20 μg，电泳程序为50 V 30 min，80 V 30 min，120 V 30 min。将蛋白转移至0.45 μm PVDF 膜上，用5%奶粉摇床室温封闭2 h；加入UCP1 兔单克隆抗体（1∶1 000）稀释，4°孵育过夜；加入HRP 标记的山羊抗兔（1∶10 000稀释）孵育1 h；进行化学发光成像。以β-tublin 为内参照，使用Image Lab 软件分析目标条带的目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。

1.7 统计学分析

全部用Graphdprism8.0 进行绘图分析，采用spss26.0 统计软件进行统计分析，试验结果采用平均数±标准差表示（X±s），组间多重比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t 检验，P＜0.05 表示差异具有显著性，P＜0.01 表示差异具有极显著性，P＜0.001 表示差异极其显著。

2 结果与分析

2.1 血脂水平

与常温（Rt）组相比，正常冷刺激（Cold）组TG 水平显著下降（P<0.05），低密度脂蛋白水平显著下降（P＜0.05），TC 水平下降，但无统计学意义（P＞0.05），高密度脂蛋白水平显著升高（P＜0.01）；与Cold 组相比，1%C、3%C 和5%C 组TG、低密度脂蛋白水平均显著减少（P＜0.05），高密度脂蛋白水平均显著升高（P＜0.05），1%C 组TC 含量显著下降（P＜0.05），3%C组下降不显著（P＞0.05），5%C 组含量上升不显著（P＞0.05）。

表1 各组小鼠血脂水平（X±s）Table 1 Blood lipid levels of mice in each group（X±s）

图1 血脂四项的变化Fig.1 Changes of blood lipid

2.2 肩胛脂肪组织形态学的变化

棕色脂肪组织主要由脂肪细胞构成，脂肪细胞内分布着大大小小的脂滴，染色过程中由于酒精和二甲苯的作用，脂滴被溶解成空泡状，因此被称为多泡脂肪细胞，核基本成圆形[8]。HE 染色结果表明，在200 倍物镜下观察，Rt 组脂肪细胞内的空泡相对较大，Cold 组及1%C、3%C 和5%C 组随着氨基酸补充浓度的增加，大空泡相对减小，小空泡相对增多（图2）。

图2 小鼠肩胛脂肪组织HE 染色形态图（×200）Fig.2 HE staining morphology of scapular adipose tissue in mice（×200）

2.3 UCP1 蛋白表达水平

Western blot 结果显示，与Rt 组相比，Cold 组UCP1 表达升高但差异无显著性（P＞0.05）；与Rt 和Cold 组相比，1%C、3%C 和5%C 组均有升高，3%C 组与5%C 组差异极显著（P＜0.01），1%C 组差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

在北方寒区畜牧生产中，冷应激是不可避免的问题，带来一系列的负面影响，包括：内环境失衡引起的生理代谢异常、免疫力下降导致的后续感冒等疾病、生产繁殖能力降低，甚至猝死[1]。如何防止动物发生不良应激或动物在应激时如何减轻一直是营养生理学家研究的主要内容，早期，杨焕民[9]研究发现 胆碱、酪氨酸与色氨酸具有较好的抗冷应激效果。

图3 Western blot 检测各组肩胛脂肪中UCP1 蛋白表达水平Fig.3 Western blot was used to detect the expression of UCP1 protein in scapular fat of each group

机体暴露在寒冷中会引起特定的急性和慢性生理反应[10]，冷暴露的急性生理反应包括血管收缩和寒颤产热，它们分别为减少热量损失和增加代谢产热[11]。血管收缩是通过反射和局部降温引起的。当身体失去热量时，血管收缩和颤抖结合在一起，维持热平衡[12]。急性冷应激通常指冷暴露的时间从5 min 到几小时，而慢性是指至少暴露24 h 以上[13]，实验小鼠连续每天放在4 °下3 h·d-1，3 周，对小鼠进行慢性冷应激，观察小鼠脂肪变化。棕色脂肪组织是非颤抖性产热的主要部位，约80%的热量产生发生在棕色脂肪组织中[14]。

生热需要能量，维持高能量消耗需要摄取葡萄糖、氨基酸和脂质作为能量底物。动物基础代谢加强，消耗甘油三酯，分解成游离脂肪酸，作为棕色脂肪产热的底物进行产热[15]。血脂四项结果显示Cold组相对于Rt 组血清中TG、TC、低密度脂蛋白下降，高密度脂蛋白升高。说明小鼠在受到寒冷刺激时，外周组织器官中的甘油三酯减少，胆固醇由血液运向肝脏增多；与Cold 组相比，补充酪氨酸与氨基酸组TG、TC、低密度脂蛋白逐渐下降，高密度脂蛋白逐渐升高，说明膳食补充剂酪氨酸联合半胱氨酸会加快冷环境下的脂肪分解。有趣的是，我们观察到TC 在1%C组、3%C 组逐步下降时，在5%C 组反弹，出现升高现象，这可能是当机体内单一成分降低时，机体为了维持正常的生理功能所作出的改变，引起的反弹现象。

结果表明在冷应激情况下，小鼠的脂肪代谢被动员，冷暴露大大加速了血液中甘油三酯的清除，这是由于棕色脂肪组织摄取增加的结果。棕色脂肪受神经支配，高度血管化，新陈代谢活跃，位于啮齿动物的肩胛处[16-20]。白色脂肪组织（Wat）是哺乳动物的主要脂肪储存器官，在细胞脂质滴中储存有大量的甘油三脂，通常每个细胞有一个大的（单眼）脂滴，与白色脂肪组织不一样的是，棕色脂肪虽然也含有脂滴，但是，这些脂滴更小，每个细胞都有许多的脂滴[21]。棕色脂肪组织在适应性产热中起着关键作用，这是一种生理过程，在此过程中能量被耗散以响应环境的变化。

接下来检测肩胛脂肪组织的变化。脂肪细胞中储存有大量甘油三酯，当受到寒冷环境刺激时，脂滴中贮存的甘油三脂将被分解为甘油和脂肪酸，脂肪细胞会变小[22]。HE 结果显示，补充酪氨酸和半胱氨酸组小鼠肩胛处脂肪脂滴相比对照组气泡减小，随着浓度的升高，气泡也逐渐缩小。与血脂结果相一致，实验结果表明合适剂量范围内酪氨酸联合半胱氨酸有利于脂肪的分解，增强基础代谢。

UCP1 是棕色脂肪产热的关键蛋白，位于线粒体内膜，负责将氧化磷酸化与ATP 的产生解偶联，从而释放能量产生热量。在冷环境下，下丘脑受到刺激，交感神经兴奋会导致儿茶酚胺神经递质去甲肾上腺素的释放，去甲肾上腺素与棕色脂肪组织的肾上腺能受体结合，启动包括环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）在内的信号级联反应，然后磷酸化并激活酶激素敏感脂肪酶（HSL），然后将甘油三酯（TG）分解为游离脂肪酸（FFA）。然后脂肪酸通过肉碱穿梭进入线粒体，氧化代谢后生成乙酰辅酶A，激活UCP1的活性。如图4 所示。酪氨酸是合成去甲肾上腺素的前体物质，有研究表明，补充酪氨酸可以提高酪氨酸比[3]，从而增加酪氨酸的水平，加快去甲肾上腺素的生物合成。实验开展了western blot 试验，对棕色脂肪关键产热性蛋白UCP1 进行检测。实验结果表明，相比于对照组，冷应激组肩胛脂肪组织UCP1 蛋白表达水平数值有所升高，虽然差异无统计学意义，仍能提示冷应激对UCP1 蛋白表达有一定的促进作用，此结果与前人结果相一致[5，14，23]。与冷刺激组相比，补充酪氨酸和半胱氨酸剂量组均表达升高，随着浓度的增加，UCP1 蛋白的表达量也增加。呈现出浓度依赖性。实验结果表明，当遭遇冷环境，机体大量产生并消耗去甲肾上腺素时，补充酪氨酸有利于机体促进去甲肾上腺素生成，从而提高棕色脂肪组织中解偶联蛋白UCP1 的表达，消耗更多的能量，以热量的形式散发出去，抵抗寒冷环境对机体造成的损伤。

UCP1 的产热机制与线粒体氧化磷酸化有关，呼吸电子传递链产生H+跨线粒体内膜的势能，在偶联状态下，势能驱使H+通过ATP 合成酶而重新回到线粒体基质中，同时将势能转化为ATP 的化学能。由于UCP1 在线粒体内膜上有特殊的通道，由电子传递链泵出的氢离子直接通过这种通道流回线粒体内，使跨线粒体内膜的质子电化学梯度消失，ADP 不能进行磷酸化形成ATP，物质氧化与ATP 生成脱偶联，即质子渗漏，而成为产热过程，能量以热能形式释放。随着热量产生的增加，呼吸对氧气的消耗，体内不可避免的会产生活性氧（ROS），ROS 可诱导不同形式的细胞氧化损伤，扰乱氧化还原状态，并可改变多种代谢酶的活性，产生氧化应激。研究人员们发现[24-26]，在冬眠状态中，发现抗氧化酶包括SOD，GSH-PX 和谷胱甘肽-S-转移酶的转录水平增加。Dusko P[27]通过比较不同动物的反应，发现最为常见的是抗氧化防御能力的增加，以及谷胱甘肽水平的提高，推测机体为可能因为缺氧引起的氧化应激而提取准备，是进化的首选。半胱氨酸作为谷胱甘肽的前体物，通过增加饲料中的半胱氨酸比，来提高谷胱甘肽的生成，增强抗氧化能力，对于动物养殖业来说。似乎是一种简单低价而又有效的方法。

4 结论

研究表明，日粮中补充氨基酸可以提高棕色脂肪产热的能力，促进脂肪分解，对机体起到保护作用。随着酪胺酸联合半胱氨酸浓度的升高，对脂质分解的影响也逐渐增长，日粮中补充3%酪氨酸联合半胱氨酸效果最好，为动物添加氨基酸最适浓度提供一定的参考。