外源白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗抗氧化系统及生长的影响

孙海燕，孔德庸，周娈，孙义卓，杜丹凤，郭伟，2

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆163319；2.黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室）

松嫩平原位于东北地区的中西部，是我国重要的商品粮生产基地，更是生态脆弱区和气象变化敏感区[1]。近些年由于气温升高，降水量减少，松嫩平原已成为干旱频发的地区之一[2]。因此，研究与应用提高作物抗旱能力的栽培技术，已成为该地区农业生产的重要措施。渗透胁迫是干旱条件下植物受到的最初危害[3]，渗透胁迫的集中反映就是膜脂过氧化，而活性氧是引起膜脂过氧化的主要因子。在正常生长条件下，植物依靠抗氧化系统控制细胞内活性氧的水平，使其在植物体内处于平衡状态，该系统的效率由系列小分子物质含量和抗氧化酶活性决定[4]。一方面，植物通过膜成分的改变和活性氧清除系统的激活来适应不利环境条件[5]；另一方面，当植物局部细胞受到非生物逆境胁迫时，还能引起全株性系统响应，使植物能够及时、高效地应对逆境胁迫[6]。活性氧的过量产生引起的植物系列反应被称为氧化应激，科学家们在植物氧化应激机制研究方面取得了重大进展。玉米作为典型的C4植物，被认为相对较少地受到活性氧的影响，由ABA、NAC 介导的信号通路、渗透保护物质合成和蛋白折叠反应被认为是玉米器官中常见的渗透胁迫应激反应[7-8]。研究表明，水杨酸[9]、亚精胺[10]、腐植酸[11]等外源物质施用均能增强玉米在渗透胁迫下的应激反应能力。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，由葡萄、花生、虎杖、桑椹等植物产生，被认为可以预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管等疾病[12]。天然的白藜芦醇以游离态和糖苷结合态两种形式在植物中分布及生物合成，且均具有抗氧化效能[13]，而外源白藜芦醇对植物的抗氧化特性的影响研究未见报道。通过对比不同胁迫时间下叶面喷施白藜芦醇处理的玉米幼苗活性氧清除酶系统活性、碳氮代谢和幼苗生长变化，以研究渗透胁迫下玉米对外源白藜芦醇的生理响应机制及适宜的叶喷浓度，为玉米的干旱胁迫研究及抗旱栽培技术的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验用玉米（Zea mays L.）品种为郑单958。白藜芦醇（Resveratrol，分子式C14H12O3，分子量228.24）由上海麦克林生化科技有限公司制造。

试验于2019 年10-11 月在黑龙江八一农垦大学的“黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室”完成。选取籽粒饱满、均匀一致的玉米种子，用2%次氯酸钠溶液浸泡消毒30 min，然后用蒸馏水反复冲洗干净，用滤纸将表面水分吸干，置于温度为20 ℃、相对湿度为70%的人工气候培养箱中黑暗培养7 d，期间根据滤纸湿度情况及时补充蒸馏水。7 d 后选取整齐一致的幼苗移植于带有圆孔的泡沫板上，将移植幼苗的泡沫板（12 株·板-1）置于盛有1/2 Hoagland 营养液的塑料方盒（20 cm×30 cm）中，在人工气候培养箱中培养，培养条件为光照度100 μmol·m-2·s-1，温度20 ℃，光暗周期为12 h/12 h，每3 d 更换1 次营养液，待幼苗第2 片真叶完全展开后（玉米三叶期）进行白藜芦醇处理。

分别采用浓度为0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1的白藜芦醇溶液进行叶面喷施，每盆喷施50 mL（即全部叶片润湿），按照上述条件继续培养。48 h 后更换营养液，同时在营养液中按照20%（W/V）加入PEG-6000 进行渗透胁迫处理，然后在人工气候培养箱中继续培养，每个处理重复4 次，分别于胁迫处理48 h 和72 h 后取样测定。

1.2 测定方法

选取生长整齐一致的10 株幼苗，分为根系与地上两部分，分别用电子天平（精度0.01 g）测定鲜重（折合成单株重量）；参照刘萍等[14]的方法采用氯化硝基四氮唑蓝光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性；采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性；采用羟胺氧化法测定超氧自由基（SAR）含量；采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛（MDA）含量；采用考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白质（SP）含量；采用蒽酮比色法测定可溶性糖（SS）含量；采用氯化三苯基四氮唑法测定根系活力。

幼苗鲜重（g·株-1）= 地上部鲜重+根系鲜重

根冠比=根系鲜重/地上部鲜重

1.3 数据处理与统计分析

利用WPS 进行数据处理、分析及绘图，SPSS Statistics 25 软件进行数据统计分析。每次取样的根系和叶片测定指标单独进行比较，Duncan 新复极差法进行差异显著性检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米抗氧化系统活性的影响

由表1 可知，渗透胁迫48 h 和72 h，白藜芦醇处理的根系SAR 含量与对照间无显著差异；而浓度>0.2 mmol·L-1处理的叶片SAR 含量显著高于清水对照；在48 h 胁迫处理下，叶片SAR 含量高于根系，随着胁迫时间的延长根系中SAR 积累大于叶片。

表1 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗抗氧化系统活性的影响Table 1 Effects of resveratrol on antioxidant system activities of maize seedlings under osmotic stress

渗透胁迫48 h，0.1 mmol·L-1白藜芦醇处理的叶片SOD 活性较对照增加了17.7%，较其它浓度处理显著增加了60.0%以上；渗透胁迫72 h，0.1 mmol·L-1白藜芦醇处理的叶片SOD 活性较对照显著增加了88.2%；与其它处理无显著差异。而白藜芦醇处理的根系SOD 活性在渗透胁迫48 h 和72 h 均与对照无显著差异。

渗透胁迫48 h 和72 h，白藜芦醇处理的叶片CAT 活性高于对照，其中0.2 mmol·L-1处理的酶活性最高，较对照分别显著增加了38.5%和18.7%；而渗透胁迫48 h，白藜芦醇处理的根系CAT 活性与对照间无显著差异，渗透胁迫72 h，仅0.2 mmol·L-1处理的根系酶活性较对照显著增加了54.1%，其它处理间差异不显著。胁迫时间的延长导致叶片CAT 活性增强和根系CAT 活性的降低，并致使根系的酶活性低于相同处理的叶片酶活性。

渗透胁迫48 h 和72 h，随着白藜芦醇处理浓度的增加叶片POD 活性呈单峰曲线，峰值浓度为0.2 mmol·L-1处理，分别较对照显著增加了33.8%和27.7%；渗透胁迫48 h，0.2 mmol·L-1白藜芦醇处理的根系POD 活性较对照分别显著增加了29.4%，其它处理与对照间无显著差异，渗透胁迫72 h，各处理间根系POD 活性无显著差异。

渗透胁迫48 h 和72 h，白藜芦醇处理的叶片MDA 含量较对照略有降低，其中0.2 mmol·L-1处理较对照分别显著降低了11.2%和14.4%。渗透胁迫48 h，0.1 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1处理的根系MDA含量较对照分别显著降低了16.9%和19.1%。渗透胁迫72 h 下，0.2~0.8 mmol·L-1处理的根系MDA 含量较对照显著降低了33.3%~37.5%。

渗透胁迫48 h 和72 h，对照的叶片SAR 含量、CAT 和POD 活性分别增加了15.3%、33.6%和40.4%，SOD 活性则降低了78.5%；对照的根系SAR含量和POD 活性分别增加了82.3%和20.1%，SOD、CAT 活性和MDA 含量分别降低了57.1%、32.0%和5.8%。与胁迫48 h 比较，胁迫72 h 的白藜芦醇处理叶片SAR 含量增加了20.0%~48.4%，CAT 活性增加了7.8%~19.4%，POD 活性增加了18.1%~60.3%，SOD活性降低45.3%~65.6%，MDA 含量降低趋势较小；不同浓度白藜芦醇处理的根系SAR 和MDA 含量增加分别增加了70.0%~104.4%和22.3%~35.1%，SOD 和CAT 活性分别降低了54.6%~57.3%和4.7%~32.1%。

渗透胁迫48 h 和72 h，叶片和根系的SAR 积累增加，同时，导致SOD 和根系CAT 活性的降低，但诱导了POD 活性和叶片CAT 活性的增强，增强了对活性氧的清除能力，使得叶片和根系的MDA 含量略有降低。白藜芦醇处理不同程度诱导了SAR 的积累，减少了叶片SOD 活性降低的程度，进一步提高了叶片和根系的CAT 和POD 活性，尤其是0.2 mmol·L-1处理效果显著，进而降低了叶片和根系的过氧化损伤，减少了MDA 含量。

2.2 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗碳氮代谢的影响

可溶性蛋白质和可溶性糖是植物体碳代谢和氮代谢两大主要代谢的重要产物，是细胞的重要渗透调节物质和植株生长的主要营养物质。另外，植物体内的可溶性蛋白质大多数是各种酶类，参与植物生长的大多数生化过程。由图1 可知，渗透胁迫48 h，随着白藜芦醇处理浓度的增加叶片和根系SS 含量呈单峰曲线，峰值分别出现在0.4 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1处理，较对照分别显著增加了29.7%和67.7%。渗透胁迫72 h，0.1~0.4 mmol·L-1白藜芦醇处理的叶片和根系SS 含量与对照间无显著差异，0.8 mmol·L-1处理较对照分别显著降低了24.1%和11.4%。胁迫时间延长导致了幼苗的SS 含量降低。

图1 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗叶片（L）与根系（R）可溶性糖含量的影响Fig.1 Effects of resveratrol on soluble sugar contents in leaves（L）and root（R）of maize seedlings under osmotic stress

由图2 可知，渗透胁迫48 h，随着白藜芦醇处理浓度的增加叶片和根系的SP 含量呈单峰曲线，峰值出现在0.2 mmol·L-1处理，较对照分别显著增加了13.0%和18.4%，其它处理与对照间无显著差异。渗透胁迫72 h，随着白藜芦醇处理浓度的增加，叶片和根系的SP 含量呈单峰曲线，峰值分别出现在0.2 mmol·L-1和0.4 mmol·L-1处理。随着胁迫时间的延长，幼苗的叶片SP 含量增加，而根系的SP 降低。

图2 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗叶片（L）与根系（R）可溶性蛋白质含量的影响Fig.2 Effects of resveratrol on soluble protein contents in leaves（L）and root（R）of maize seedlings under osmotic stress

综合分析，渗透胁迫时间延长导致了根系SS 和SP 含量的降低，以及叶片SS 和SP 含量的增加；而白藜芦醇处理不同程度的增加了短时间胁迫下植株的SS 和SP 含量，促进了长时间渗透胁迫下植株中SP的合成。

2.3 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米根系活力及幼苗鲜重的影响

由图3 可知，渗透胁迫时间的延长导致对照的根系活力降低了78.2%，而白藜芦醇不同程度的提高了渗透胁迫下玉米幼苗的根系活力，有利于缓解长时间渗透胁迫对根系活力的损伤。随着白藜芦醇处理浓度的增加根系活力先增加后降低，其中0.2 mmol·L-1处理的根系活力最大，48 h 和72 h 渗透胁迫下分别较对照显著增加了35.7%和75.1%。

图3 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗根系活力的影响Fig.3 Effects of resveratrol on root system activity of maize seedlings under osmotic stress

由表2 可知，渗透胁迫72 h 对照处理的地上部鲜重和根系鲜重较胁迫48 h 均有所增加，而白藜芦醇处理（0.1~0.4 mmol·L-1）的地上部鲜重均不同程度的降低，根系鲜重和植株鲜重增加，根冠比提高。随着白藜芦醇处理浓度的增加，幼苗地上部鲜重呈单峰曲线，48 h 渗透胁迫下0.1~0.4 mmol·L-1处理的地上部鲜重较对照显著增加了15.2%~22.8%，根系鲜重显著增加了21.6%~43.2%，植株鲜重显著增加了20.7%~30.5%；72 h 渗透胁迫下仅0.2 mmol·L-1处理的地上部鲜重显著增加了8.5%，而根系鲜重显著增加了36.4%，植株鲜重显著增加了16.5%。由此可见，白藜芦醇可能以牺牲地上部物质积累，保护和促进根系发育的方式降低渗透胁迫。

表2 白藜芦醇对渗透胁迫下玉米幼苗鲜重的影响Table 2 Effects of resveratrol on fresh weight of maize seedlings under osmotic stress

3 讨论

植物渗透胁迫的重要表现就是活性氧的积累，进而引起膜脂过氧化[15]。因此，加强活性氧的清除，是玉米幼苗抵御渗透胁迫的重要机制。渗透胁迫下植物会产生超过正常水平的SAR[16]，诱导植物抗氧化系统响应，首先就是SOD 活性的增强，将更多的SAR还原成H2O2，H2O2积累导致CAT、POD 等酶活性的增强和植物的系统响应[17]。纳米氧化锌诱导玉米抗旱性的研究表明[18]，干旱胁迫引起叶片亚细胞超微结构的改变、丙二醛和渗透物质的积累，100 mg·L-1纳米氧化锌能促进褪黑激素的合成，激活抗氧化酶系统，缓解了干旱对线粒体和叶绿体的损伤。研究中白藜芦醇叶面处理增加了玉米幼苗的SAR 产生量，诱导了叶片和根系的SOD、CAT 及POD 活性，增加了氧自由基的清除能力，降低了MDA 含量。白藜芦醇的临床应用研究表明，白藜芦醇激活SIRT1 基因的表达，增强过氧化物酶体活性[19]。作为天然抗氧化剂，白藜芦醇主要是通过清除或抑制自由基生成，抑制脂质过氧化、调节抗氧化相关酶活性等机制发挥抗氧化作用[20]。研究发现在植物中2%左右的基因表达是受H2O2调控的[21]，介导了一系列的保护酶[22]和抗性机制[23]。100 mmol·L-1外源腐植酸处理玉米种子的研究结果也表明，渗透条件下适宜浓度的H2O2可以诱导CAT、POD 等保护酶活性的增加[11]。但H2O2浓度超出一定范围将导致抗氧化酶的失活[24]。研究发现渗透胁迫时间从48 h 至72 h，植株抗氧化酶活性降低，而白藜芦醇处理则有效的缓解了抗氧化酶活性的下降。白藜芦醇增强了渗透胁迫下玉米的CAT、POD 等抗氧化酶活性，小白鼠的胰岛素耐受性试验也表明，白藜芦醇处理是通过降低活性氧的水平和恢复抗氧化酶活性，而提高线粒体复合物活性及系统抗性[25]。

研究发现，白藜芦醇提高了渗透胁迫下玉米幼苗的代谢水平，尤其是加强了氮代谢，在短时间的渗透胁迫下，植株的光合碳代谢和氮代谢均得到不同程度的强化。渗透胁迫是破坏栽培植物代谢过程和细胞结构的主要环境压力之一[26]，玉米在低温或干旱条件下，蔗糖积累减少导致了细胞渗透电位的降低[9，27]，而耐逆性强的玉米蔗糖转运蛋白和水孔蛋白含量显著增加，韧皮部转载蔗糖能力提高[28]，而提高植物小分子渗透调节物质含量正是增强植物耐逆性的重要途径[29]。长时间的渗透胁迫下，白藜芦醇处理更有利于叶片可溶性蛋白质的合成及向根系的运输。大部分可溶性蛋白质为各种酶类，因此，可溶性蛋白质含量的提高可增强根系的抗氧化能力[30]。白藜芦醇可能通过加强根系的抗氧化性，提高渗透胁迫下根系活力，增加根冠比，进而增强渗透胁迫下植株的物质积累能力。而逆境条件下提高生长速率也正是植物适应逆境的重要方式之一[31]。

4 结论

营养液培养的玉米幼苗在PEG 渗透胁迫下处理72 h，SAR 含量较48 h 处理激增了15.3%，SOD、CAT和POD 活性降低，可溶性糖和蛋白质积累减少。叶面喷施白藜芦醇可不同程度的增强幼苗SOD、CAT 及POD 活性，降低了MDA 含量。渗透胁迫48 h，白藜芦醇处理促进了可溶性糖的合成及向根系的运输；而渗透胁迫72 h，白藜芦醇处理增强了根系活力，加强了叶片的氮代谢及可溶性蛋白质向根系的运输。48 h和72 h 渗透胁迫下，白藜芦醇处理的植株鲜重较清水对照分别显著提高了30.4%和16.5%，综合分析发现叶面喷施0.2 mmol·L-1白藜芦醇是最适宜的处理浓度。