硅烷化聚琥珀酰亚胺负载阿维菌素的制备与性能

苏少纯，林成威，周新华，3，周红军，2

（1 仲恺农业工程学院化学化工学院，广东省普通高校农用绿色精细化学品重点实验室，广东广州 510225；2 植物健康创新研究院，广东省普通高校果蔬病虫害可持续防治重点实验室，广东广州 510225；3 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东茂名 525000）

农药对农作物保护和病虫害防治起着必不可少的作用。据报道，2050 年全球人口将达到98亿，这对可持续的粮食供应和发展是一种重大挑战。另一方面，由于病虫害的威胁，农作物的质量和产量都面临挑战。因为农药的疏水性，在使用过程中需要加入大量溶剂进行分散，农药易分解的特点，增加了所需农药剂量和施药次数。大量溶剂和药物的施用不仅破坏了生态系统平衡，也对人体和动植物的安全和健康造成了威胁。阿维菌素（AVM）作为一种典型的疏水性生物农药，具有广谱的杀虫、杀螨、抗寄生虫等优势。因其水分散性差、易被光降解和氧化分解，传统剂型添加大量的分散剂或乳化剂等来提高分散性，同时加入光保护助剂等来保持药效，但这些有机溶剂的添加会带来食品安全和生态环境风险。因此，急需发展具有良好的防治效果、低成本、环境友好型的高效农药。利用纳米技术将传统农药包封或吸附在纳米材料中制备纳米化农药，具有解决传统农药在使用过程中诸多缺陷的巨大潜力。纳米农药通过修饰改性，可具有小尺寸、高比表面积、抗紫外和抗氧化性能等特点，可显著提高农药的水分散稳定性，有利于提高农药在靶标组织中的润湿沉积能力。Peng 等制备了自分散木质素载药材料，应用于阿维菌素纳米制剂，得到载药结构具有自乳化和分散能力、良好的物理化学稳定性和控释性能。Hao 等制备功能化氮化硼纳米片的复合纳米载体负载AVM，所合成的纳米杀虫剂具有高负载能力、高效的水分散性、pH 响应性释放、超强的抗紫外性能以及在植物表面的黏附能力。Song 等合成羧甲基壳聚糖-纳米碳材料负载甲维菌素苯甲酸酯，改善了药物溶解度、稳定性和抗紫外性能。由此可得，以天然材料为基础的新型农药载体在农业和作物保护领域开辟了新途径。

聚琥珀酰亚胺（PSI）是一种生物相容性好和易改性的材料，具有可生物降解和亲水性，一直受到人们关注，被广泛应用于食品、医疗和化妆品等行业。在PSI 的主链上加入刺激响应基团（腙键、胺键和硫醇等），使其具有各种环境刺激响应性。例如，Hill 等报道了聚琥珀酰亚胺与伯胺的功能化，以提高其生物降解性、pH 响应性和在农业中的定点释放。Xin 等合成了新型聚琥珀酰亚胺纳米颗粒，可以增强植物的水分吸收，降低铜胁迫的抑制，同时有效促进植物种子在胁迫下的萌发和生长。Wu 等制备了甘氨酸甲酯改性聚琥珀酰亚胺纳米颗粒，通过韧皮部靶向递送控制香蕉枯萎病。这些合成PSI 纳米颗粒可以控制农药在靶标作物传递，进一步降低其所需浓度和环境风险。

本文以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）作为功能化单体和丁二胺（DBA）作为亲水端改性PSI，制备得到两亲性载体材料（PDSi，如图1），并通过自组装方式封装AVM。利用FTIR、TGA、SEM、DLS动态光散射激光粒度仪和接触角仪对载药前后改性聚琥珀酰亚胺进行了表征。基于不同APTES的添加量修饰PSI，以期实现AVM具有良好的叶面黏附性、抗氧化性能、抗紫外性能和pH 响应性释放等目的。

图1 PDSi的合成过程

1 实验材料和方法

1.1 原材料与主要仪器

聚琥珀酰亚胺（PSI，98%），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，分析纯），丁二胺（DBA，分析纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿维菌素（AVM，工业级，纯度为95%），河北威远生物化工有限公司；溴化钾（分析纯），广州化学试剂厂；二甲基亚砜（DMSO，分析纯），浓盐酸（分析纯），过硫酸钾（KPS，分析纯），无水乙醇（分析纯），天津大茂化学试剂有限公司。

傅里叶变换红外光谱仪，Spectrum-100型，美国赛默飞世尔科技公司；TGA2 型同步热分析仪，美国梅特勒-托利多仪器公司；扫描电子显微镜，Zeiss Sigma 300 型号，德国卡尔蔡司股份公司；Theta 光学接触角仪，瑞典百欧林科技有限公司；紫外分光光度计，UV-2550型，日本岛津公司。

1.2 材料制备

1.2.1 3-氨丙基三乙氧基硅烷-聚琥珀酰亚胺（PDSi）的制备

按照表1，将20mmol PSI（97g/mol琥珀酰亚胺单体）完全溶解于20mL DMSO，取不同摩尔比的APTES 和DBA 溶解于20mL DMSO，将上述溶液在室温下混合均匀并且搅拌24h，得到的溶液放入透析袋（MWCO=3500）中72h，冷冻干燥得到纯化的PDSi样品。

表1 PSI、APTES和DBA三种单体的摩尔比和样品的载药率

1.2.2 AVM@PDSi的制备

称取100mg PDSi 样品超声分散在95mL 水中，在磁力搅拌下加入5mL AVM 乙醇溶液（4mg/mL），室温磁力搅拌1h，得到AVM@PDSi体系。

1.3 结构表征及性能测试

1.3.1 结构表征

利用红外光谱仪分析PSI 和PDSi 的化学结构，采用KBr 压片法在4000～450cm波长扫描；采用热重分析法（TGA）对PSI和PDSi的热稳定性进行测试和表征，以10℃/min 的速率在氮气气氛下由40℃加热到600℃；通过SEM 观察微观形貌和结构，PDSi 和AVM@PDSi 溶液置于导电胶上进行室温干燥，并喷金处理。

1.3.2 载药率测试

取4mL 新鲜制备的AVM@PDSi 于离心管中，在12000r/min 速度下离心10min。取1mL 上清液置于10mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇定容。在波长为245nm 的紫外分光光度计下测定游离AVM 的吸光度。根据标准曲线公式=0.0225+0.004（R=0.9995） 算出AVM 浓度，按式(1)计算载药率（，%）。

式中，为体系AVM总质量；为体系中未包封的阿维菌素质量；为加入该体系载体样品的总质量。

1.3.3 接触角

研究AVM 乙醇水溶液、 AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 溶液在黄瓜叶片外表面的静态接触角，以表征农药对叶片的润湿性。新鲜黄瓜叶用去离子水清洗，然后在环境温度下干燥15min。使用光学接触角仪测试黄瓜叶上的接触角。每个样品在黄瓜叶片的不同位置测试3次。

1.3.4 叶面滞留量

将冲洗后晾干的叶片裁成2cm×2cm，浸泡在样品溶液15s 后，用镊子垂直提起至无液滴落下，放置分析天平称重，重复三次。按式(2)计算滞留量（LHC）。

式中，和分别表示浸泡前后叶片的质量；表示叶片的表面积。

1.3.5 抗氧化性能

本研究采用Pan 等的方法，测定PDSi-1、PDSi-2和PDSi-3三种样品对1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 的清除能力。将1mL DPPH 乙醇溶液（0.2mmol/L） 和2mL 的样品溶液（0～5.0mg/mL）混合均匀，在26℃下磁力搅拌1h。在0 和1h 分别测试517nm的吸光度。每个样本平行测量三次。按式(3)计算DPPH自由基的清除率（）。

式中，A为DPPH 在=0 时的浓度；A为DPPH在1h时的浓度。

1.3.6 抗紫外性能

将5mL AVM 乙醇溶液（4mg/mL）分散在去离子水中，制备得到200mg/L AVM 水分散体。AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 制成200mg/L。然后将50mL 不同样品分散到不同石英管中，置于光化学反应器内，每个样品距离汞灯（300W，=365nm）5cm 处。在特定的时间间隔内，取出1mL 样品，用无水乙醇定容至10mL，并在245nm处用紫外可见分光光度计测定吸光度。根据标准曲线公式=0.2637+0.0057 （R=0.9994）算出AVM 浓度，按式(4)计算不同照射时间样品中AVM保留率（，%）。

式中，为AVM在溶液中的初始浓度；A为不同光照时间后样品中的AVM浓度。

1.3.7 缓释性能

分别取5mL AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 置于透析袋内，分别加入50mL 40%乙醇水溶液作为释放介质。在室温下，每隔一段时间取1mL缓释液于10mL棕色容量瓶中，用40%乙醇水溶液定容，在245nm处测定吸光度，同时向体系中补加1mL 40%乙醇水溶液。按标准曲线=0.0225+0.004 （R=0.9995） 计算得到AVM 的含量，并按式(5)计算AVM的累积释放率（，%）。

式中，C为每个样品在不同时间间隔时AVM的浓度，为AVM的总质量。

1.3.8 储存稳定性

以GB/T 19136—2003 标准为依据， 对AVM@PDSi-3 溶液的稳定性进行了测试。将纳米颗粒装在玻璃瓶中，分别在0℃储存7 天，在25℃和54℃储存14 天；然后，采用DLS 动态散射法评价其平均粒径和多分散系数（PDI）的变化。

1.3.9 杀虫活性

小菜蛾（由河南济源白云实业有限公司提供）于16h 光/8h 暗进行循环饲养4 天（虫龄为2 龄后期）。采用浸叶法，测定市售AVM 乳油和AVM@PDSi-2 溶液的杀虫活性。将相同尺寸的上海青叶片在1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、 40mg/L 和80mg/L 市售AVM 乳油和AVM@PDSi-2 溶液中浸泡5min 后，自然晾干。将浸泡去离子水的叶片作为空白样品。将干燥的叶片放入培养皿中喂养10 只小菜蛾。培养皿置于27℃培养箱，记录处理48h后小菜蛾的死亡数。通过统计和概率分析确定各样品的半致死浓度（）和毒性回归方程。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱

由图2可得，PSI在2949cm主要是—CH—的伸缩振动，在1797cm主要是相邻羰基的耦合效应，1715cm是由于琥珀酰亚胺环上C==O 的伸缩振动，1167cm主要是五元环循环胺结构的C—C单键，表明一个五元循环胺结构的存在。在图2的PDSi-1、PDSi-2 和PDSi-3 的曲线中，1797cm的吸收峰消失，说明相邻羰基的耦合效应减弱甚至消失，主要是PSI 胺解开环引起的；1659cm和1543cm出现了明显的吸收振动峰，这是PSI 接枝了DBA 和APTES 所形成C==O 和C—N 键的振动吸收峰；说明PSI成功胺解开环并成功接枝；此外，1085cm处出现较宽的振动吸收峰，这是APTES中Si—O 键的伸缩振动峰。由此可知，DBA 和APTES成功接枝到PSI上。

图2 PSI、PDSi-1、PDSi-2和PDSi-3的红外光谱

2.2 TGA-DTG分析

从图3 的TG 曲线可看出，PSI 分解温度始于280℃，这归因于PSI链末端—OH和—NH基团的缩合反应；在350～420℃有明显的分解过程，这是由于PSI 上C—H 键的分解，PSI 大部分失重，失重率为42%。对于PDSi-1、PDSi-2 和PDSi-3。第一阶段是在200～360℃，这对应于DBA的氨基分解和APTES的硅氧烷降解，失重率约为20%。第二阶段始于360℃，主要的失重峰出现在450℃，这对应于PSI 的C—H 键的分解，失重率为40%。由图3的DTG曲线可知，PSI的最大分解温度为390℃，而PDSi-1、PDSi-2 和PDSi-3 的最大分解温度分别出现在325℃和450℃附近，与PSI相比，325℃可能是接枝单体分子的分解引起，450℃可能是PSI 的分解，说明DBA和APTES成功接枝到PSI上。

图3 PSI、PDSi-1、PDSi-2和PDSi-3的热重分析（TG）和导数热重（DTG）曲线

2.3 载药率和微观形貌

探索了不同APTES 添加量对AVM@PDSi 载药率的影响。从表1 可知，PDSi 对AVM 能起到较好的载药效果，这是由于APTES具有较强的亲油性，对疏水性AVM 能起到束缚作用。由表1 可得，PDSi-1 的载药率为14.97%±0.014%，PDSi-2 的载药率为14.94%±0.003%，PDSi-3 的载药率则为15.11%±0.005%。这表明载药率基本一致，且载药率和接枝比例没有明显的关系。

图4 展示了PDSi-2 和AVM@PDSi-2 扫描电镜图和通过Image-Pro-Plus9.0 软件统计得到的粒径分布图。PDSi-2 的平均粒径在(183.19±31.95)nm，粒子为扁塌形、表面粗糙且凹凸不平[图4(a)]，这可能是两亲性的PDSi 结构在水溶液中受疏水作用所形成。当PDSi-2负载AVM后，平均粒径下降至(78.14±7.99)nm，观察到粒子的形状近似为球状和椭圆形，可能是由于AVM的进入使PDSi-2的疏水作用增强，粒子收缩，粒径减小，球形规整度升高。

图4 PDSi-2和AVM@PDSi-2的SEM及粒径分布

2.4 叶面润湿性

农药在叶面的亲和性非常重要，润湿性好的农药有助于活性成分更快在叶面铺展和沉积。通过测试不同样品溶液在黄瓜叶片上的静态接触角、表面张力和叶面滞留量来表征农药的润湿性。从图5可以得到AVM 乙醇水溶液与黄瓜叶片的接触角为84.55°±2.55°，说明AVM乙醇水溶液与黄瓜叶片的接触角较大，叶片的表面润湿性较差。另外，AVM@PDSi-1 在叶片上的接触角为74.04°±1.18°，明显小于AVM 乙醇水溶液。此外，接触角由AVM@PDSi-1 的74.04°±1.18°减小到AVM@PDSi-3的67.30°±0.23°。可见，PDSi 样品溶液的润湿性优于AVM 乙醇水溶液，且接触角随着APTES 比例的增加而减小。这是由于APTES 的加入降低了溶液的表面张力[如图6(a)所示]，使溶液更快在叶面上铺展，有效提高AVM 在叶面的润湿性。以叶面滞留量作为评判标准，用AVM 乙醇水溶液作为空白对照，相同浓度的AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2和AVM@PDSi-3 在黄瓜叶面的滞留量情况如图6(b)所示，AVM 乙醇水溶液在叶面的滞留量为(10.39±1.30)mg/cm，而AVM@PDSi-3 的滞留量最高是(16.26±1.73)mg/cm，比AVM 乙醇水溶液提高了56.50%，说明封装的AVM 具有良好的黏附能力。这表明PDSi 载体材料有助于降低表面张力和接触角，增加叶面的滞留量，提高叶面的润湿能力，使更多药剂保留，有利于农药的减施增效。

图5 AVM乙醇水溶液、AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2和AVM@PDSi-3在黄瓜叶面上的接触角

图6 AVM乙醇水溶液、AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2和AVM@PDSi-3的表面张力和在黄瓜叶上的滞留量的分布

2.5 抗氧化性

DPPH 在有机溶剂中是一种较稳定的自由基，对DPPH 的清除率与抗氧化活性有关，清除率越高，抗氧化活性越强。据报道，外源硅可通过提高植物的抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量来提高抗氧化防御能力，也有助于渗透调节和增加光合酶活性，促进植物生长。如图7 所示，在0～5mg/mL浓度范围内，随着PDSi的浓度增加，PDSi对DPPH的清除率呈现上升趋势，这主要是接枝的APTES发挥作用，说明PDSi 载体材料具有良好的抗氧化能力。另外，在相同浓度下，PDSi-2的清除率要略高于PDSi-1和PDSi-3。

图7 不同浓度PDSi-1、PDSi-2和PDSi-3对DPPH清除率的情况

2.6 抗紫外性

由图8 可知，AVM 乙醇水溶液的半衰期是325min，连续照射540min 后，其AVM 的保留率只剩下39.02%。 而AVM@PDSi-1 的半衰期为430min，AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 的半衰期是480min；在照射540min 后，AVM@PDSi-1 的剩余率是45.05%，AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 的剩余率分别为49.29%和48.13%。这是由于PDSi载体作为物理屏障阻隔了紫外光照射，减弱了紫外线对AVM 的照射分解，从而延长了AVM 的半衰期，减缓了AVM的光降解速率。

图8 AVM乙醇水溶液、AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2和AVM@PDSi-3在紫外照射下的AVM保留率

2.7 缓释性能

在温度为30℃、 pH 为7 的条件下，AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 的载药体系进行缓释实验，结果如图9。在释放初期（最初10h），这三种载药体系显示快速释放，这是由于未封装AVM 的释放。而在持续释放45.5h 后，AVM 的释放呈现稳定。此时，AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2 和AVM@PDSi-3 的累积释放率分别为 87.87%±3.39%、 67.32%±1.28% 和 87.67%±1.28%。由表1可知，三种载药体系的载药率接近。图8曲线差异，推测是由于所接枝上两种单体的比例不同，PDSi-1 接枝的氨基发挥主导作用，载体的亲水性较强，在水溶液的溶胀性较好，更易释放AVM；也可能是氨基对AVM 有较强的静电吸附作用，而吸附在载体表面的AVM 更易释放到外部环境。与PDSi-1 和PDSi-3 相比，PDSi-2 释放AVM的速率最慢，这可能是PDSi-2 结构的亲疏水链段达到一定的平衡，AVM@PDSi-2 亲水端的溶胀性与疏水端的束缚性相持恒。

图9 AVM@PDSi-1、AVM@PDSi-2和AVM@PDSi-3的释放AVM情况

在不同酸碱条件下，AVM@PDSi-3 释放AVM情况如图10 所示，PDSi-3 在碱性条件下有利于释放AVM。在pH 为9 时，缓释率是最高为96%，比中性条件下提高了9%，比酸性条件提高了4%。这可能是在碱性条件下，改性聚琥珀酰亚胺所含的琥珀酰亚胺发生碱性开环，提高了其亲水性，使其内部结构进一步溶胀，加快了释放AVM。

图10 AVM@PDSi-3在不同pH下累积释放AVM的情况

2.8 储存稳定性

农药制剂的长时间储存稳定性在农业中是一个重要的因素。为了评估AVM@PDSi-2 的储存稳定性，样品溶液在0℃储存7 天，在25℃和54℃储存14天，测量其平均粒径和多分散系数的变化情况。如图11所示，在0℃下储存7天和在25℃下储存14天后，颗粒尺寸的变化可以忽略不计，PDI的浮动在0.1 之内。在54℃储存14 天粒径显著降低而PDI显著上升，这是因为表面自由能随着温度升高而增加，且体系分散性略为下降。结果表明，样品溶液储存在不同温度下具有一定稳定性。

图11 AVM@PDSi-3在不同条件下的粒径分布和多分散系数（PDI）

2.9 杀虫活性

为了评价硅烷改性聚琥珀酰亚胺封装AVM 的生物活性，以半致死浓度（）和95%置信限作为毒性标准。表2比较了AVM@PDSi-3和市售乳油AVM的毒性。市售AVM乳油和AVM@PDSi-3中的值分别为13.72mg/L和32.08mg/L。AVM@PDSi-3 封装AVM 提高了，表明PDSi-3 由于界面阻挡层作用对AVM 具有保护作用和缓释作用，提高了AVM持效性，延长了AVM达到靶标虫体的作用时间。此外，对于这三种情况下的95%置信范围，AVM@PDSi-3 的值有一部分位于以市售AVM乳油的情况，说明AVM@PDSi-3 对AVM 的毒性作用与和市售乳油相当。

表2 市售AVM乳油和AVM@PDSi-2的杀虫活性结果

3 结论

（1）通过红外光谱（FTIR）和TGA-DTG 分析，表明APTES和DBA已经接枝到PSI上。

（2）利用自组装方法将AVM 包覆于PDSi，所制得的载药纳米粒子具有球状结构，其中AVM@PDSi-2的平均粒径为(78.14±7.99)nm。

（3）纳米载药体系提高了疏水性AVM 的水分散性和稳定性，赋予了AVM 良好的抗紫外能力，实现了AVM的缓慢释放且持续释放超过48h，同时可以通过调节pH大小来控制药物的释放速率。

（4）纳米载药体系增加了农药在植物叶片的滞留量，减少了农药的流失、分解以及有机溶剂的使用。利用可降解的PDSi 载体对农药进行纳米化处理，为绿色农业的实施提供一种可行的解决方案。