离子液体辅助酶法提取姜黄素类化合物工艺优化

谭 索，司瑞茹，强悦越，韦 航，黄 彪，曾绍校，陆东和，傅建炜,

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建福州 350003；3.福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建福州 350003）

姜黄素类化合物是分布在姜黄、莪术和郁金等姜黄属植物中的天然多酚化合物，主要包括姜黄素（curcumin，Cur，75%～80%）、脱甲氧基姜黄素（demethoxycurcumin，DMC，3%～5%）和双脱甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin，BDMC，15%～20%）等，结构如图1 所示。姜黄素类化合物呈橙黄色针状/结晶粉末，不溶于冷水和乙醚，易溶于乙醇和乙酸。近年来大量研究表明姜黄素类化合物具有促进健康的作用，包括抗癌、抗菌、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等，并且由于其细胞毒性较低，高剂量给药无副作用，几个世纪以来在亚洲被广泛使用，常作为香料、防腐剂、着色剂和治疗剂等应用于食品或医疗领域。

图1 姜黄素类化合物的结构Fig.1 Structure of curcuminoid

目前，提取姜黄素类化合物的传统方法有乙醇回流法、酸碱提取法、水杨酸钠法、活性炭吸附法等。这些传统的提取方法耗时长、提取率低、耗费大量有机试剂。此外，姜黄素为弱酸性物质，碱液提取时会导致其分解为香兰素、阿魏酸和阿魏酰甲烷等。酶法提取也是提取植物活性成分常用的方法，酶法提取是利用适当的酶来破坏植物细胞壁，使得活性成分更容易被提取出来的方法，具有产物回收率高、溶剂用量少等优点。如齐瑞芳等和肖秀丽均采用纤维素酶、淀粉酶及木瓜蛋白酶组成的复合酶提取姜黄素，得到的产品质量稳定，反应条件易控制，但提取工艺中酶解反应时间大概需要2～4 h，因此酶法提取也面临着酶解时间长的问题。基于此，近年来发展了多种新技术来辅助酶法提取姜黄素类化合物，如超临界CO萃取法、超声辅助提取法和微波辅助提取法，但这些方法都需要特定的仪器设备，价格昂贵，操作费用大，成本高，不适合工业运用。

离子液体由有机阳离子和无机或有机阴离子组成，是绿色化学新兴研究领域之一。传统溶剂只能依靠浓度差来完成提取，离子液体可以通过溶解纤维素来溶解部分植物细胞壁达到提取的目的，从而增大提取率和缩短提取时间。同时离子液体能够有效稳定酶-底物的过渡态，降低反应活化能，使酶表现出较高的催化活性。徐佳琳、王佳等报道采用过离子液体提取姜黄素类化合物，并指出离子液体可以提高姜黄素类化合物的提取率。利用离子液体辅助酶法提取姜黄中姜黄素类化合物的工艺鲜见报道。

本研究采用离子液体（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐）辅助酶法提取姜黄素类化合物，主要研究了离子液体与酶对姜黄素类化合物提取率的协同效果，考察了不同因素对姜黄素类化合物得率的影响，并通过响应面法优化提取工艺，以期为获得得率高、经济节约的姜黄素提取工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

姜黄 江西樟树天齐堂中药饮片有限公司；纤维素酶（酶活≥400 U/mg）、果胶酶（酶活≥500 U/mg）、木聚糖酶（酶活≥6000 U/mg）、半纤维素酶（酶活≥2 U/mg）、-淀粉酶（酶活≥50 U/mg）上海宝曼生物科技有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐 麦克林有限公司；姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素标准品 纯度≥95%，坛墨质检-标准物质中心；柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇等均为国产分析纯。

SPD-M40 超高效液相色谱仪 岛津公司；TDL-5-A 离心机 上海安亭科学仪器厂；IKA VXR B S025旋涡振荡 器 德国IKA 公司；AL204 电子天平 瑞士METTLER TOLEDO 公司；800Y 高速多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；HD-2500 多管漩涡混合仪 杭州佑宁仪器有限公司；Sun Fire C柱色谱柱（4.6 mm×150 mm, 3.5 μm） 美国沃特世公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶法提取姜黄素类化合物 将姜黄粉碎后过80 目筛，称取一定质量的姜黄粉于离心管中，加入20%（酶：姜黄粉）的纤维素酶，再按料液比1:10 加入pH4.8 缓冲溶液，混匀，置于60 ℃恒温振荡水浴锅中酶解70 min；酶解结束后取出离心管按料液比1:10（姜黄粉：无水乙醇）加入无水乙醇，2500 r/min涡旋振荡5 min 后，于4500 r/min 离心5 min，取出上清液，稀释一定倍数后用高效液相色谱测定姜黄素含量。

1.2.2 乙醇法提取姜黄素类化合物 将姜黄粉碎后过80 目筛，称取一定质量的姜黄粉于离心管中，按料液比1:20（姜黄粉：50%乙醇）加入50%乙醇，2500 r/min 涡旋振荡5 min 后，于4500 r/min 离心5 min，取出上清液，稀释一定倍数后用高效液相色谱测定姜黄素含量。

1.2.3 离子液体辅助酶法提取姜黄素类化合物 将姜黄粉碎后过80 目筛，称取一定质量的姜黄粉于离心管中，加入20%（酶：姜黄粉）的纤维素酶，再按料液比1:10（姜黄粉:缓冲液）加入含15%的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的pH4.8 缓冲溶液，混匀，置于60 ℃恒温振荡水浴锅中酶解70 min；酶解结束后取出离心管按料液比1:10（姜黄粉:无水乙醇）加入无水乙醇，2500 r/min 涡旋振荡5 min 后，于4500 r/min 离心5 min，取出上清液，稀释一定倍数后用高效液相色谱测定姜黄素含量。

1.2.4 姜黄素类化合物的测定 采用液相色谱法，参照安徽省地方标准《食品中姜黄素含量的测定 液相色谱法》，并做适当调整。姜黄提取物中姜黄素的分析采用UltiMate 3000 HPLC（Thermo SCIENTIFIC）进行。色谱柱：C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Welch材料）；柱温：30 ℃；洗脱液：纯乙腈-0.5%乙酸水（50:50，v/v），等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；检测波长：425 nm；检测时间：10 min。

1.2.5 姜黄素类化合物标准曲线 分别准确称取10 mg 姜黄素标准品、脱甲基姜黄素标准品、双脱甲基姜黄素标准品， 用甲醇定容至10 mL，作为混合标准储备液。分别吸取不同体积的标准储备液，用甲醇稀释成浓度为100、500、1000、2000、4000 ng/mL的标准工作液。将混合标准溶液在上述色谱条件下进样分析，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 姜黄素类化合物得率测定

式中：X 为姜黄中姜黄素类化合物得率，%；C 为测定液中姜黄素类化合物浓度， g/mL；V 为提取液体积，mL；N 为稀释倍数；m 为姜黄质量，g。

1.2.7 酶的筛选 按照1.2.1 的提取方法，从纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和-淀粉酶中选出最佳酶，以姜黄素素类化合物得率为指标，进行酶的筛选。

1.2.8 姜黄素类化合物提取工艺条件优化

1.2.8.1 单因素实验 分别考察酶解pH（3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0），离子液体添加量（0%、5%、10%、15%、20%、25%），酶添加量（5%、10%、15%、20%、25%、30%），酶解时间（30、50、70、90、110、130 min）和酶解温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对姜黄素类化合物得率的影响。

1.2.8.2 响应面试验 在单因素实验的基础上，以酶解pH、离子液体添加量、酶用量、酶解时间和酶解温度为自变量，设计Box-Behnken 试验优化提取条件（表1），以姜黄素类化合物得率为评价指标，确定离子液体协同酶法提取姜黄素类化合物的最适条件。

表1 响应面试验的因素和水平设计Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3 数据处理

采用 Design-Expert 10.0 软件进行响应面试验设计，Origin 2019 软件进行数据分析。实验数据均为三次平行实验的均值。＜0.05 为具有统计学意义的显著差异，*＜0.05，**＜0.01。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

利用高效液相色谱法分析姜黄素类化合物混合标准溶液，以峰面积为纵坐标（Y）， 以测定浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，Cur、DMC、BDMC 三者的回归方程及相关系数见表2。

表2 标准曲线方程表Table 2 Table of standard curve equations

2.2 不同提取方法对姜黄素类化合物得率的影响

以姜黄素类化合物得率为指标，乙醇提取法为对照，研究了添加酶以及添加酶-离子液体对得率的影响，三种不同提取方法对姜黄素类化合物得率的影响结果如图2 所示。可以看出，加酶后姜黄素类化合物得率有所提高，但并不显著高于乙醇法提取（＞0.05），在加入离子液体后，得率显著高于乙醇法提取和酶法提取（＜0.05）。王佳等的研究出现类似的结果，其采用离子液体-乙醇浸提姜黄中的姜黄素，比用乙醇-浸提的提取率提高了0.316%。

图2 不同提取方法对姜黄素类化合物得率的影响Fig.2 The effects of different extraction methods on the yield of curcuminoid

从结果可知，离子液体对姜黄素类化合物的提取有较大影响。离子液体既能作为生物催化介质，提高酶的活性及酶解产物的得率，同时离子液体能够有效稳定酶-底物的过渡态，降低反应活化能，使酶表现出较高的催化活性。有研究表明，姜黄素与离子液体可能通过氢键、疏水相互作用和π-π 相互作用达到增溶效果，在咪唑类离子液体中，碳链越长，对姜黄素的增溶效果越高。

与果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶和-淀粉酶相比，使用纤维素酶酶解后的姜黄素类化合物的得率更高。姜黄细胞壁主要由纤维素和半纤维素组成，纤维素容易产生分子内氢键及纤维素链之间的分子间氢键，并聚集形成纤维素微纤丝。当提取溶液中加入适量的纤维素酶时，能有效地破坏姜黄的细胞壁，提高提取效率。因此，选择纤维素酶进行离子液体辅助酶法提取姜黄素类化合物的工艺优化。

2.3 单因素实验

2.3.1 酶解pH 对姜黄素类化合物得率的影响 对不同pH 条件下纤维素酶-离子液体法对姜黄素类化合物的得率进行评价，结果如图3 所示。从图中可以看出，不同的酶解pH 对姜黄素类化合物的提取率没有显著影响（＞0.05），随着pH 的变化，得率仅发生较小波动。得率在pH3.0～5.4 范围内随pH 的增大而增大，在pH5.4 时姜黄素类化合物得率达到5.49%，当pH＞5.4 时，姜黄素类化合物得率呈现下降趋势。这是由于酶的活性存在一个最佳pH 范围，酶解pH 越接近纤维素酶的最适pH，纤维素酶的活性就越高。有研究表明，pH 可以改变底物和酶分子的带电状态，影响底物和酶的结合，大于或者小于最适的pH，都会使得酶活性会显著降低，同时也会引起蛋白的变性，从而影响酶的活性。姜黄素类化合物的溶出率也受pH 的影响，其在碱性条件下的溶解率更高，但极不稳定，容易分解为香兰素、阿魏酸和阿魏酰甲烷等，而在酸性条件溶解率较低，但稳定性较好，这可能是pH3.0～6.0 时对姜黄素类化合物得率影响不显著的原因。因此，选用pH4.8～6.0 进行响应面优化试验。

图3 酶解pH 对姜黄素类化合物得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of curcuminoid

2.3.2 离子液体添加量对姜黄素类化合物得率的影响 离子液体添加量对姜黄素类化合物的影响如图4 所示。可以看出，当离子液体添加量在0%～20%范围时，姜黄素类化合物得率随着离子液体添加量的增加而增加，添加量为20%时，姜黄素类化合物得率达到最大值。随着离子液体添加量的增加，姜黄素类化合物得率下降。

图4 离子液体用量对姜黄素类化合物得率的影响Fig.4 The effect of ionic liquid dosage on the yield of curcuminoid

由结果可知，离子液体添加量对得率有较大影响。离子液体具有较强的催化活性，在与酶结合提取姜黄素时，可以提高酶的活性。适当的离子液体添加能够增强纤维素酶的催化活性，当离子液体添加量较低时，可能影响非酶水解反应速率，从而使反应初速率受到影响。但当离子液体添加量过多时，由于其本身较高的黏度，会使得溶剂提取体系的黏度增大，降低了传质速率，使得有效成分的扩散能力下降，不仅影响了姜黄素类化合物的溶出，还阻碍了纤维素酶与底物的结合，从而影响到纤维素酶的催化作用，降低酶解速率。因此，选择添加量为15%～25%离子液体进行响应面优化试验。

2.3.3 酶添加量对姜黄素类化合物得率的影响 纤维素酶添加量对姜黄素类化合物的影响如图5 所示。从图中可知，酶添加量由5%增加到30%时，姜黄素类化合物得率总体上呈现先增加后降低的趋势。在酶添加量为15%时，姜黄素类化合物得率到达最大值；当酶添加量大于15%时，姜黄素类化合物得率又呈下降趋势。当酶添加量由5%增加到15%时，反应体系中纤维素酶对细胞壁的破坏程度随酶添加量的增大而增大，细胞内膜的通透性增加，传质阻力降低，因此姜黄素类化合物得率呈增加趋势。而当酶用量过大时，姜黄素类化合物提取呈现下降趋势，当酶过饱和时，也会增加提取液的粘稠度，不利于提取，导致得率下降，戴浩等采用酶解组合高速匀浆法提取人参中皂苷和多糖的研究中出现了类似的变化趋势。因此，选择添加量15%～25%纤维素酶进行响应面优化试验。

图5 酶添加量对姜黄素类化合物得率的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on the yield of curcuminoid

2.3.4 酶解时间对姜黄素类化合物得率的影响 不同酶解时间对纤维素酶-离子液体法提取姜黄素类化合物得率的影响结果如图6 所示。可以看出，酶解时间在30～90 min 范围内，姜黄素类化合物得率缓慢增加，这可能由于在水浴振荡的作用下，样品和酶充分接触，促进了样品的酶解。当酶解时间超过90 min，水浴振荡使样品和酶继续不断碰撞，破坏了姜黄素类化合物的结构，姜黄素类化合物得率下降。因此，选择70～110 min 进行响应面优化试验。

图6 酶解时间对姜黄素类化合物得率的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of curcuminoid

2.3.5 酶解温度对姜黄素类化合物得率的影响 酶解温度对姜黄素类化合物的影响如图7 所示。可以看出，在酶解温度为30～60 ℃时，姜黄素类化合物得率呈现上升趋势。温度大于60 ℃时，酶会逐渐失去活性，姜黄素类化合物得率呈现下降趋势。有研究表明，姜黄素类化合物在高于65 ℃时会发生降解因此，选择50～70 ℃进行响应面优化试验。

图7 酶解温度对姜黄素类化合物得率的影响Fig.7 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of curcuminoid

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面试验设计及结果 在单因素实验结果的基础上，依据Design-Expert 10.0 软件中的Box-Behnken 法，以得率为响应值,设计5 因素3 水平试验来进行提取工艺的优化。选取的试验因素与水平见表2，设计方案与试验结果见表3。

表3 响应面试验的设计方案与结果Table 3 Design scheme and results of response surface experiment

对拟合的响应面模型进行方差分析和显著性检验后结果如表4 所示。

利用Design-Expert 10.0 软件对表3 中的数据进行回归拟合,得到如下回归方程：Y=6.00+0.019A-0.12B+0.15C+0.0065D-0.0005E+0.026AB+0.015AC+0.005AD-0.057AE+0.023BC-0.034BD+0.082BE+0.013CD-0.036CE+0.01DE-0.28A-0.71B-0.28C-0.39D-0.41E

由于失拟项=0.9963，影响不显著，说明除了已知因素的影响外，其他因素对试验结果没有显著的影响，且该模型的＜0.0001，说明此模型的应变量与自变量的线性关系是显著的。模型的决定系数=0.956，说明预测值与实测值之间具有较高相关性，该模型拟合程度较好。校正决定系数=0.921，表示可以用此数学模型解释92.1%的姜黄素类化合物得率的变异性。综上述分析，该方程拟合良好，可以应用此模型预测和分析实验结果。

2.4.2 响应因子水平的优化 图8 为根据回归分析结果做出相应的立体响应面图，进一步直观说明酶解pH、离子液体添加量、酶添加量、酶解时间、酶解温度之间的交互作用以及各因素对姜黄素类化合物得率的影响程度。从图中可以看出，随着各因素水平的升高或延长，姜黄素类化合物得率先增加后减少。结合表4 中5 因素值可知，5 因素对姜黄素类化合物得率的影响力：酶添加量＞离子液体添加量＞酶解pH＞酶解时间＞酶解温度。

图8 两因素交互作用对姜黄素类化合物得率的响应面图Fig.8 Response surface diagram of the interaction between the two factors on the yield of curcuminoid

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for regression model

经Design-Expert 10.0 分析优化，可得到离子液体协同酶法提取姜黄中姜黄素类化合物的最佳工艺条件为酶解pH5.4，离子液体20%，酶用量21%，酶解时间90 min，酶解温度59 ℃。在此条件下，根据方程得到的得率预测值为5.922%，验证实际得率为5.882%，与理论得率相对误差为0.04%。

3 结论

本文以姜黄为原料，采用离子液体辅助酶法提取姜黄素类化合物，利用酶破坏姜黄的细胞壁，通过离子液体提高酶的活性，缩短酶解时间，减少有机溶剂的用量，并提高姜黄素类化合物得率。通过Design-Expert 10.0 软件分析实验数据可得到提取姜黄中姜黄素类化合物的最佳工艺为：酶解pH5.4，离子液体20%，酶用量21%，酶解时间90 min，酶解温度59 ℃。在该工艺下姜黄素类化合物理论得率可达到5.922%，验证实际得率为5.882%，比同等条件下50%乙醇的得率4.595%高出1.287%。这个结果表明该方法可以有效提取姜黄中的姜黄素类化合物，为姜黄素资源的开发利用提供了参考。