猪链球菌在呼吸道上皮细胞中感染特性的研究

张 浩，杨 巍

（1.伊犁职业技术学院动物科学学院，新疆 伊宁 835000；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

猪链球菌（Streptococcus suis）是球形革兰氏阳性菌。由S.suis感染引起的猪链球菌病是一种非常重要的人兽共患传染病，在全世界范围内均有发生，不仅严重制约了全球范围内生猪养殖业的健康发展，也给人类的公共卫生安全带来了巨大的隐患[1-2]。S.suis作为一种条件致病菌，广泛存在于猪呼吸道、消化道和生殖道中，其中呼吸系统是链球菌感染的重要靶器官，可以引起肺炎、脑炎、关节炎等多系统疾病[3]。但是，目前S. suis在呼吸系统中的感染特性和致病机制仍不清楚，链球菌定植的靶细胞及吸附特性也有待进一步研究。呼吸道上皮作为呼吸系统重要组成部分，是多种呼吸道病原体感染的靶器官。其组成主要包括纤毛细胞、粘液生成细胞和基底细胞。有研究表明，不同的呼吸道病原体利用不同的靶细胞感染呼吸道上皮细胞：例如，A 型流感病毒主要感染纤毛细胞也可以感染粘液生成细胞[4]；人呼吸道合胞体病毒不仅能够感染纤毛细胞而且还能够感染基底细胞，从而影响呼吸道上皮细胞的修复和分化功能[5]。

本研究建立了两种猪呼吸系统体外培养体系：猪肺组织精细切片（Precision-cut lung slices，PCLS）和上皮细胞气液培养体系（Gas-liquid interface，ALI）。PCLS 是一种肺组织的原代培养体系，在肺组织精细切片中所有细胞均处于原生位置。因此，PCLS 为观察肺脏组织的组织学结构、呼吸道收缩功能、揭示呼吸道病原体在肺组织中的感染特性提供了一种有用的研究模型[6]。ALI 是模拟呼吸道上皮的原代细胞培养体系，在空气-液体界面条件下培养的原代呼吸道上皮细胞能够进一步诱导分化为杯状细胞、非纤毛和纤毛上皮细胞等不同亚型细胞的呼吸道上皮细胞[7]，与常规细胞系相比，ALI 培养体系不仅是分析呼吸道上皮功能的优秀模型，也是研究病原体感染机制的有效技术平台。在2019 年暴发的新冠病毒的研究中，Hoffmann 等科学家利用人呼吸系统体外培养体系鉴定出新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S 蛋白能够利用上皮细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2）感染呼吸道上皮细胞[8]。

细菌的吸附与定植过程是其成功感染宿主的关键环节，本研究利用构建的上述两种猪呼吸系统体外培养体系，分析了S. suis在呼吸系统的感染特性，鉴定了S.suis主要感染的靶细胞和吸附特点，为今后S. suis在呼吸系统的感染研究提供平台和基础，为阐明S.suis在猪呼吸系统中的致病机制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料3 月龄SPF 猪购自达硕实验动物有限公司；低熔点琼脂糖购自Promega 公司；DMEM 和1640 细胞培养基、β-微管蛋白抗体和羊抗兔IgG-FITC 购自Sigma 公司；胎牛血清购自Clark 公司；青霉素和链霉素购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所诊断中心；卡那霉素购自北京索莱宝科技有限公司；链球菌10 型菌株及anti-S. suis多抗由本实验室保存；上皮细胞培养试剂购自Lonza 公司；上皮细胞培养小室购自Corning 公司。

1.2 PCLS 的制备及S. suis感染后的检测参照文献[9]，取3 月龄SPF 猪的新鲜肺脏组织，分别分离5个肺小叶，将1%的低熔点琼脂溶液注入到新鲜健康的肺小叶中。待琼脂凝固后，将猪肺小叶制备成适当大小的组织块，然后用活组织切片机制备精细切片并培养于24 孔板中，通过光学显微镜观察纤毛摆动情况，选取纤毛活性良好的PCLS 用于后续试验。制备的PCLS 用含有抗生素的DMEM 培养基处理24 h，再用无抗生素培养基培养24 h。将S. suis接种到PCLS 上并培养4 h（1.0×107cfu/孔）。孵育4 h 后洗去未吸附的细菌，用PBS 洗3 次后，补充新鲜培养液并继续培养24 h 后，分别以cy3-β-微管蛋白抗体（1：300）和anti-S. suis多抗（1：200）为一抗，羊抗兔IgG-FITC（1：500）为二抗，经间接免疫荧光试验（IFA）检测。

1.3 猪呼吸道上皮纤毛细胞的制备及S. suis感染后的检测参照文献[10]，分离新鲜的原代猪呼吸道上皮细胞置于细胞培养瓶中扩大培养。当细胞长满单层后，将细胞转移到细胞培养小室中培养，培养小室的上部和下部均加入新鲜培养液。当小室内的细胞长满单层后，去除半透膜上部的培养液，让细胞处于气-液条件下培养3 周～4 周。待上皮细胞分化良好后，可用光学显微镜观察纤毛分化程度，当纤毛分化达到60%时，该上皮细胞即为高度分化的猪呼吸道上皮细胞，可用于后续试验。

分离的上皮细胞在气-液条件下培养4 周以后，选取上皮细胞纤毛分化超过60%的细胞进行试验，用针头小心在部分上皮细胞表面划出创面，人为造成损伤，继续培养6 h 后用1.0×107cfu 的S. suis感染损伤和未损伤的上皮细胞ALI 培养体系的基顶侧，孵育4 h 后弃去未吸附的细菌，用PBS 洗3 次。感染后的上皮细胞ALI 培养物保持在气-液培养条件下，继续培养24 h，分别以cy3-β-微管蛋白抗体（1：300）和anti-S. suis多抗（1：200）为一抗，羊抗兔IgG-FITC（1：500）为二抗，经IFA 检测。

1.4 扫描电镜检测S. suis在ALI 培养体系中的吸附特性为更直观的鉴定S. suis在上皮细胞ALI 培养体系中的吸附特性，本研究分别选取1.3 中S.suis感染后的上皮细胞，参照文献[11]，利用戊二醛预固定24 h，锇酸处理2 h，乙醇脱水，使用临界点干燥法进行干燥，采用离子溅射镀膜法对样品进行导电处理后在扫描电子显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 S. suis在PCLS 中定植的IFA 检测结果PCLS是一种原代肺组织体外培养体系，既包含肺组织也包含支气管，在PCLS 中所有细胞均处于原生位置，与自然机体保持一致。利用PCLS 研究S.suis在肺组织中感染24 h 后的吸附情况，结果显示，S. suis能够感染PCLS，并且在感染24 h 后能够检测到大量的S.suis吸附在支气管管腔表面，其中红色标记的上皮细胞指示的是支气管上皮管腔表面，绿色标记的是S.suis菌体（图1A、图1B）。表明，S.suis能够吸附、定植于支气管上皮细胞表面，也证实PCLS培养体系能够应用于S.suis在肺组织及支气管中感染特性的研究。

图1 S.suis（绿）感染PCLS中纤毛上皮细胞（红）的IFA检测Fig.1 Detection of S.suis(green)infection on ciliated epithelial cells(red)by immunofluorescence staining

2.2 S. suis在ALI 中吸附定位的IFA 检测结果本研究建立了猪呼吸道支气管上皮纤毛细胞ALI 培养体系，利用该体系分析S.suis在支气管上皮细胞中的吸附特性。ALI 是能够模拟呼吸道上皮屏障结构的原代细胞体外培养体系。在空气-液体界面条件下培养的原代呼吸道上皮细胞能够被诱导分化为不同种类的呼吸道上皮细胞，比如杯状细胞、非纤毛和纤毛上皮细胞等[7]。有报道称，S. suis可以通过皮肤的伤口感染宿主，并引起多系统疾病[12]。因此，在上皮纤毛细胞ALI 培养体系中，用针头在分化四周的细胞表面划出创面，人为造成上皮细胞损伤后，利用S. suis感染正常的或者受损的上皮纤毛细胞ALI 培养物，经IFA 检测，结果显示，S. suis能够吸附于上皮纤毛细胞表面，主要吸附于纤毛细胞表面（图2A，红色显示为纤毛细胞，绿色显示S. suis菌体）。由于纤毛细胞的纤毛中含有丰富的微管蛋白，因此抗β-微管蛋白抗体能够特异性鉴定纤毛细胞。创伤细胞感染试验显示受损细胞处的细菌数明显高于未损伤细胞表面吸附的细菌数（图2B），上皮细胞的细胞核被标记为蓝色（图2C、图2D）。表明S. suis更容易定植于受损伤的ALI 细胞创面周围，进一步证实上皮细胞损伤能够促进S.suis的吸附作用。

图2 S.suis吸附在ALI中的纤毛细胞及损伤的上皮组织周围的IFA检测Fig.2 Decetion of adherence of S.suis to ciliated cells and around injured epithelial tissue of ALI culture by immunofluorescence staning

2.3 S. suis在ALI 培养体系中吸附特性的扫描电镜观察结果在上述基础上，本研究进一步通过扫描电镜技术鉴定了S. suis在上皮细胞ALI 培养体系中的吸附特性，结果显示，S. suis呈长链状吸附在纤毛上皮细胞的纤毛表面（图3 红色箭头所示）。

图3 S.suis吸附在纤毛细胞纤毛表面（箭头指示吸附的S.suis）的电镜检测Fig.3 Decetion of adherence of S.suis to ciliated cells(Arrow indicates attached S.suis)by scanning electron microscopy

呼吸系统利用纤毛细胞的摆动功能和黏液生成细胞分泌的黏液共同执行自洁功能，将呼吸道黏液吸附的病原微生物排出呼吸系统。细菌吸附与定植的过程是其成功感染宿主的关键环节，当细菌感染呼吸系统并干扰宿主的自洁功能时，将会增加细菌在宿主体内定植的能力，从而增加细菌的致病力。本研究电镜观察结果表明，S. suis吸附在纤毛表面不利于呼吸系统清除该菌，宿主不能利用纤毛-黏液清除功能将S. suis清除出机体，反而增加了S. suis在支气管上皮中定植的能力。

本研究利用两种呼吸系统体外培养体系进行了S. suis在呼吸系统中的感染特性，首次直观地鉴定了S. suis主要感染的靶细胞为支气管上皮纤毛细胞，并且利用扫描电镜首次证明了S.suis在纤毛细胞中吸附的位置为纤毛表面。该研究结果说明当S.suis感染呼吸系统时，宿主不能通过纤毛的自洁功能将其清除体外。本研究为阐明S.suis在猪呼吸系统中的致病性提供数据支持，为今后链球菌在呼吸系统的感染的研究提供平台和基础。