乳酸菌及丙酸钙对全株玉米和燕麦青贮饲料发酵品质和霉菌毒素含量的影响

田吉鹏，刘蓓一，顾洪如，丁成龙*，程云辉，玉柱

（1. 江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014；2. 农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014；3. 中国农业大学草业科学与技术学院，北京 100193）

玉米（Zea mays）和燕麦（Avena sativa）均为一年生禾本科植物，产量和营养价值高，抗性强，是我国反刍动物主要的粗饲料来源［1］。在我国，全株玉米主要以制作全株玉米青贮饲料为主。而燕麦主要通过田间晾晒制作干草，但是在多雨季节仍可能会受到雨水影响而腐烂发霉，因此通过调制青贮亦是有效保存燕麦营养成分的重要技术。

全株玉米具有丰富的可溶性碳水化合物和较低的缓冲能值，不需要添加剂也能发酵良好。但是有氧暴露后酵母菌和霉菌等快速繁殖容易造成有氧腐败从而导致饲料安全问题如霉菌和霉菌毒素污染［2］。燕麦因含水量及缓冲能值较高而且可溶性碳水化合物含量较低等问题，单独青贮成功率较低，为此需要添加添加剂及适当的萎蔫［3］处理才能保证青贮成功。添加合适的添加剂能够有效改善青贮饲料的发酵品质、抑制有害微生物生长与增殖、保存营养物质、降低青贮饲料中霉菌毒素含量。目前常用的添加剂主要有复合乳酸菌添加剂以及有机酸盐等［4］。复合乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）添加剂能够有效提高青贮饲料发酵品质和有氧稳定性［5］。丙酸盐能够提高青贮饲料的丙酸含量，抑制丁酸梭菌、霉菌和酵母菌等有害微生物生长，从而提高青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性［6］。目前全株玉米青贮多集中于镰刀弯地区，而燕麦多在青海、西藏、内蒙古、东北等地区［7］。相对而言我国长江淮河流域全株玉米和燕麦青贮对于抑制有氧腐败问题和霉菌毒素污染的需求更为迫切，但相关乳酸菌和丙酸钙的复合添加剂研发较少。目前本课题组自主研发的乳酸菌复合添加剂能够有效提高稻秸（Oryza sativa）和大麦（Hordeum vulgare）等青贮饲料的发酵品质［8-9］，但是在燕麦和玉米青贮饲料中尚未验证过。鉴于全株玉米和燕麦在我国反刍动物粗饲料的占比较大，因此有必要研究复合乳酸菌添加剂及丙酸盐对本地全株玉米和燕麦青贮饲料的发酵效果。本研究通过乳酸菌制剂及丙酸盐在全株玉米和燕麦青贮饲料中复合利用，分析添加剂对两种青贮饲料发酵品质、微生物数量、营养品质、有氧稳定性和霉菌毒素含量的影响，探讨适合本地全株玉米和燕麦青贮饲料的添加剂组合，为全株玉米燕麦青贮饲料加工和利用提供科学依据和技术依托。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全株玉米来源于江苏省农业科学院六合实验基地，2019 年9 月蜡熟期收获，留茬高度5 cm，收获后立即粉碎成2～3 cm 的小段。燕麦来自盐城大丰鼎旺饲料有限公司，2019 年6 月乳熟期收割后作为试验材料，留茬高度5 cm，收获后粉碎成2～3 cm 小段然后置于阴凉处萎蔫4 h。复合乳酸菌由江苏省农业科学院畜牧所自主研发，主要包括植物乳杆菌、布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌菌种（各菌添加比例为2∶1∶1），总体添加量为5×105CFU·g-1。采用试剂级丙酸钙（calcium propionate，PACA,4075-81-4），购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试验设计

利用双因素完全随机设计开展试验，全株玉米和燕麦原料分别用蒸馏水（CK 组），复合乳酸菌（LAB 组），丙酸钙（PACA），复合乳酸菌及丙酸钙（LAB+PACA 组）进行处理，每个处理3 个重复。其中乳酸菌添加量为5×105CFU·g-1鲜样，丙酸钙添加量为鲜样的0.4%。

将全株玉米用汽油粉碎机（CX20，日照洋工园林机械有限公司）均匀切割为2～3 cm 的小段并混合均匀，燕麦采用饲料公司的大型收割粉碎一体机（JAGUAR900，德国克拉斯农机公司）直接进行粉碎后取样。将乳酸菌制剂加入6 mL 灭菌脱脂奶粉溶液中室温活化2 h，加入适量水（60 mL）溶解均匀喷洒进青贮料中。称取12 g 丙酸钙溶于60 mL 蒸馏水中。每个处理3 个重复，每个重复3.0 kg，分别均匀喷洒60 mL 的乳酸菌菌悬液或者丙酸钙浑浊液，CK 组加入等量60 mL 蒸馏水，然后装入大号青贮袋中抽真空密封。全部处理完成后放入储藏室中遮光储存120 d。开封后将3.0 kg 青贮料利用五分法取约500 g 用于发酵、微生物和营养品质的测定，剩下2.5 kg 装入5 L 塑料桶中用于有氧稳定性的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1发酵品质测定 开封后取混合均匀后的青贮料20 g，加入180 mL 水后放入4 ℃冰箱中浸提24 h，然后用4 层纱布和定性滤纸过滤，得到浸提液保存于-20 ℃冰箱中，用于后期pH 值、氨态氮和有机酸含量的测定。采用玻璃电极pH 计（FE20，瑞士梅特勒-托利多集团）测量pH 值。参考许庆方等［10］的方法采用高效液相色谱仪（1260，美国安捷伦科技有限公司）测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。色谱条件如下：色谱柱：Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C（8.0 mm×30 cm，日本岛津公司），进样体积5 μL，流动相为3 mmol·L-1HClO4，流速为1 mL·min-1，柱温为60 ℃，检测波长为210 nm，运行时间20 min。采用苯酚-次氯酸钠法测定氨态氮含量［11］，最后计算氨态氮占总氮的比值。

1.3.2微生物数量测定 另取混合均匀的20 g 新鲜样品加入180 mL 灭菌生理盐水，振荡混匀30 min 后用于乳酸菌、酵母菌和霉菌的测定。提取液在超净工作台中进行梯度稀释后用MRS 培养基（北京路桥）37 ℃恒温培养48 h 后进行乳酸菌的计数，用孟加拉红培养基28 ℃恒温培养3～7 d 进行霉菌和酵母菌的计数。

1.3.3营养品质测定 取300 g 样品放在105 ℃烘箱中杀青15 min，然后65 ℃烘干约48 h 至恒重，称重计算干物质含量（dry matter，DM），烘干后样品粉碎过1 mm 筛用于营养价值的检测。采用凯氏定氮法检测总氮（total nitrogen，TN）含量［12］，以TN×6.25 进行计算粗蛋白含量，采用范氏法［12-13］测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量（Ankom200i 纤维检测仪，美国Ankom 科技有限公司），采用蒽酮比色法测定可溶性碳水化合物含量［14］，采用高氯酸-蒽酮比色法测定淀粉含量［15］。

1.3.4有氧稳定性测定 取2.5 kg 青贮料松散放入5 L 青贮桶中，在青贮料中心部位安装温度记录仪（MDL-1048A，中国上海天河自动化仪表有限公司）温度传感探头，然后用纱布覆盖桶口后在室温条件下进行有氧稳定性的测定。每小时记录各个青贮桶中的温度1 次，将每次青贮桶中温度值与室温值相减制作温差Δt的动态变化图（图1），以Δt超过2 ℃的时间记为该重复的有氧稳定性时间（h）。

图1 玉米和燕麦青贮饲料有氧暴露期间温度差Δt（样品温度-室温）变化Fig. 1 Curve of Δt（temperature difference between sample temperature and room temperature）during aerobic exposure of corn and oat silages

1.3.5霉菌毒素测定 青贮饲料开封后每个重复立即取两份各50 g 鲜样在-20 ℃条件下进行单独保存，并尽快用于霉菌毒素的检测。采用ELISA 检测试剂盒（北京中检维康生物技术有限公司）检测黄曲霉毒素B1 含量，采用ELISA 检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司）检测玉米赤霉烯酮含量，在酶标板微孔条上预包抗原，样本中相应毒素和此抗原竞争抗体，酶标二抗催化TMB 底物显色，样本吸光值与其含有的相应毒素呈负相关，与标准曲线比较得出样品中对应霉菌毒素的含量，具体方法见试剂盒说明书。

1.4 数据分析

采用Excel 2016 对数据进行整理、初步分析和图表制作，用SPSS 20.0 数据处理系统进行进一步统计分析。利用一般线性模型对原料（material，M）、添加剂（additive，A）以及交互效应（M×A）进行方差分析。方差分析显著（P＜0.05）进一步进行多重比较，采用Tukey 法进行多重比较。各处理以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料发酵品质的影响

添加剂对两种原料青贮后的饲料品质所测定指标均有显著影响（表1），且不同原料、添加剂与青贮原料之间存在显著的交互效应（P＜0.01）。就燕麦青贮结果而言，CK 组的pH 值达到4.73。LAB、PACA、LAB+PACA能够显著降低燕麦青贮饲料的pH 值（P＜0.05）。而对于玉米青贮饲料来说，添加剂对pH 无显著降低效果，且PACA 能够显著提高玉米青贮饲料的pH 值（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 处理组在玉米和燕麦青贮饲料中都能够显著提高青贮饲料的乳酸含量（P＜0.05），而LAB 处理组仅在燕麦青贮饲料中具有显著提高效果（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 显著提高了燕麦青贮饲料的乙酸含量（P＜0.05）。只有PACA 和LAB+PACA处理组能够增加两种青贮饲料的丙酸含量（P＜0.05），LAB 处理组和CK 组差别不大且含量极少。检出的丁酸主要存在于燕麦青贮饲料当中，LAB 组能够降低燕麦青贮饲料中的丁酸含量，PACA 和LAB+PACA 处理组丁酸的检出量为0。玉米青贮饲料中未检出丁酸含量，且氨态氮含量低于10%，LAB 和LAB+PACA 处理组仅从数值上相对于CK 组较小。燕麦青贮饲料中氨态氮含量较高，CK 组达到21.38%。添加剂的使用显著降低了燕麦青贮饲料的氨态氮含量（P＜0.05）。

表1 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料发酵品质的影响Table 1 Effects of additives on fermentation quality of corn and oat silages

2.2 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料微生物数量的影响

添加剂和原料对2 种青贮饲料的微生物数量（表2）均具有显著影响（P＜0.01），且添加剂和原料在乳酸菌（P＜0.01）、酵母菌（P＜0.05）和霉菌（P＜0.01）数量上均存在显著的互作效应。在玉米青贮饲料中LAB+PACA 处理组显著降低了乳酸菌、酵母菌和霉菌的数量（P＜0.05），PACA 处理组对于霉菌数量也有显著的降低效果（P＜0.05）。在燕麦青贮饲料中各处理组乳酸菌和霉菌数量相差不大。燕麦青贮饲料中霉菌数量极少，只有对照组有一个重复检出少量霉菌。添加剂的使用能够显著降低燕麦青贮饲料中酵母菌的数量（P＜0.05），其中LAB+PACA 处理组效果最好（P＜0.05）。

表2 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料微生物数量的影响Table 2 Effects of additives on microbial counts of corn and oat silages（lg CFU·g-1）

2.3 添加剂对玉米和燕麦青贮化学成分的影响

燕麦青贮饲料的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、可溶性碳水化合物和淀粉含量与全株玉米均有显著差异（P＜0.01），且从整体上看，添加剂的使用显著影响了粗蛋白（P＜0.01）、中性洗涤纤维（P＜0.05）、可溶性碳水化合物和淀粉含量（P＜0.01）。添加剂和原料在干物质（P＜0.01）、粗蛋白（P＜0.05）和可溶性碳水化合物（P＜0.01）含量中存在显著的交互效应。LAB+PACA 显著降低了燕麦青贮饲料的干物质含量（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 降低了玉米青贮饲料的粗蛋白含量并显著提高了可溶性碳水化合物含量（P＜0.05），而对燕麦青贮饲料则无显著影响（表3）。

表3 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料化学成分的影响Table 3 Effects of additives on chemical composition of corn and oat silages

2.4 添加剂对玉米和燕麦青贮有氧稳定性和霉菌毒素的影响

玉米和燕麦青贮饲料在有氧稳定性、黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮含量之间存在显著差异（P＜0.01）。燕麦青贮饲料的有氧稳定性均超过168 h，而玉米青贮饲料有氧稳定性则均低于84 h。PACA 和LAB+PACA 显著提高了玉米青贮饲料的有氧稳定性（P＜0.05），其中PACA 的效果最好，而LAB 则没有提高玉米青贮饲料的有氧稳定性。添加剂的使用从总体上对霉菌毒素无显著影响，LAB 和LAB+PACA 显著降低了玉米青贮饲料的黄曲霉毒素B1 的含量（表4）。

表4 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料有氧稳定性和青贮开封时霉菌毒素含量的影响Table 4 Effects of additives on aerobic stability of corn and oat silages and mycotoxin contents after silo opening

燕麦青贮饲料在168 h 的温度监控过程中始终没有超过室温1 ℃（图1）。而在玉米青贮饲料中，经过91 h 的有氧暴露，最终所有处理组Δt均高于2 ℃。其中CK、LAB 和LAB+PACA 组最高温度超过室温5 ℃。单从降低温度差角度来看，在21 h 内LAB、PACA 和LAB+PACA 效果接近，51 h 之内PACA 和LAB+PACA 效果相近，超过51 h 后PACA 效果最好。

3 讨论

3.1 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料发酵品质的影响

青贮开封后所有玉米青贮饲料感官表现都很好，发酵品质也都表现优良，未检出丁酸，这主要是由于收获和青贮加工进行了严格的控制。青贮玉米收获期控制在蜡熟期乳线达到1/2 左右的时候，干物质含量控制在32.21%～34.21%，正是全株玉米青贮发酵的最适条件［16］。本研究所用乳酸菌制剂为复合乳酸菌制剂，里面同时包含了同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌，能够在降低青贮饲料pH 值的同时提高乙酸等有机酸含量并抑制霉菌等有害微生物［8］。但是异型发酵乳酸菌（布氏乳杆菌）在玉米青贮饲料中未能提高乙酸产量，这可能是由于青贮pH 值降得太低，严重抑制了布氏乳杆菌在发酵稳定阶段的活性，使得复合乳酸菌制剂主要发挥了植物乳杆菌的效果，对乙酸含量无影响，这与Miao 等［17］的研究结果一致。玉米青贮饲料中缺乏丁酸菌，丁酸含量极少，本研究中丙酸含量的增加靠的是丙酸钙的添加，这与卢冬亚等［6］的研究结果一致。

燕麦青贮饲料缓冲能值较高，需要大量的可溶性碳水化合物来快速降低pH 值，较慢的pH 值下降速度容易导致丁酸梭菌等有害微生物的繁殖，从而降低青贮饲料质量，因此燕麦青贮饲料通常需要萎蔫来抑制有害微生物［18-19］。本试验中燕麦青贮饲料CK 组有难闻味道，虽然经过萎蔫使得干物质含量提高到38%左右，但是丁酸含量仍然严重超标。这与葛剑等［20］的研究结果相反，可能与燕麦品种、所在区域等不同有关。李平等［3］研究认为燕麦青贮饲料不宜长时间萎蔫。本研究中萎蔫后CK 组的丁酸含量仍然很高。但是通过乳酸菌的添加能够有效抑制燕麦青贮饲料中的丁酸发酵，提高燕麦青贮饲料发酵质量。相关研究表明，植物乳杆菌等同型发酵乳酸菌能够有效提高燕麦青贮饲料发酵品质并且降低丁酸含量［21］。而布氏乳杆菌对于燕麦青贮饲料的发酵品质和丁酸含量所起作用有限［22］。丙酸钙以及丙酸钙和乳酸菌的复合添加剂降低丁酸的效果更为明显，主要是因为提高了燕麦青贮饲料中的丙酸含量，而丙酸的提高能够降低青贮饲料中的丁酸含量［23］。

3.2 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料微生物数量的影响

乳酸菌是可利用碳水化合物产生大量乳酸的一类革兰氏阳性菌的总称。在青贮饲料中的氧气耗尽后，乳酸菌尤其是植物乳杆菌能够产生乳酸快速降低青贮饲料的pH 值。当pH 值小于4.2 时有害微生物受到抑制，但是乳酸菌本身也会受到抑制，乳酸菌的数量也会减少［24］。玉米和燕麦青贮饲料中的乳酸菌数量均处于发酵稳定期。其中玉米青贮饲料的pH 普遍低于4.0，乳酸含量较多，使得玉米青贮饲料中乳酸菌受到抑制从而使得数量大大减少。而燕麦青贮饲料pH 普遍高于4.2，乳酸菌数量普遍较多。酵母菌和霉菌是导致玉米等青贮饲料有氧变质的主要原因［25］。在不同原料当中，酵母菌和霉菌的差异除了发酵品质以外，主要还有淀粉等非纤维性碳水化合物的含量。燕麦的淀粉含量仅有玉米青贮的1/3，其酵母菌和霉菌数量普遍较少。研究表明，复合乳酸菌制剂能够有效降低青贮饲料中的酵母菌和霉菌数量［26］。同样地，丙酸盐对于青贮饲料中的霉菌和酵母菌也具有抑制作用。本试验中，添加剂的使用或多或少都对酵母菌和霉菌数量有一定的抑制作用，其中效果最好的是乳酸菌与丙酸钙的复合添加剂。

3.3 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料化学成分的影响

本试验中所用玉米青贮饲料营养品质优良。添加剂尤其是丙酸钙或丙酸钙和乳酸菌复合添加剂的使用显著提高了青贮饲料的淀粉和可溶性碳水化合物含量，相应地降低了粗蛋白和纤维组分的含量。这进一步说明丙酸钙等添加剂抑制了酵母菌和霉菌等的繁殖和对于淀粉、可溶性碳水化合物等能量物质的消耗，保留了更多的非纤维类营养物质。这与宗成等［27］的研究结果相一致。燕麦的粗蛋白含量丰富，许多时候超过10%［28］。但本试验燕麦青贮过程中蛋白质发生降解产生了大量的氨态氮，使得燕麦青贮饲料的粗蛋白保持在8%左右。添加剂的使用能够有效降低燕麦青贮饲料的氨态氮含量、提高粗蛋白含量，与张晴晴等［29］的研究结果相一致。

3.4 添加剂对玉米和燕麦青贮饲料有氧稳定性和霉菌毒素的影响

孙志强等［30］研究表明，添加植物乳杆菌和布氏乳杆菌的复合乳酸菌添加剂对全株玉米青贮饲料的发酵品质无显著影响，但是能够有效提高青贮饲料的有氧稳定性，且受青贮玉米品种的影响。本试验中复合乳酸菌的使用没有增加乙酸的含量，并且有氧稳定性相比于对照组仅增加了约6 h，且没有统计学上的显著关系。这可能是受乙酸含量不足的影响，也可能是受到品种和不同地区微生物菌群的影响。而乙酸、丙酸等有机酸对于玉米青贮饲料中的有害微生物具有显著的抑制效果［31］，有助于提高玉米青贮饲料的有氧稳定性［4］。同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌复合使用对于提高玉米青贮饲料的有氧稳定性具有重要作用［32］，但是在一些特定条件下乳酸菌尤其是异型发酵乳酸菌的效果不稳定，添加适合的有机酸添加剂是十分必要的。而本试验当中燕麦青贮饲料有氧稳定性好，全部超过168 h，这与贾婷婷等［33］的结果（CK 组大于168 h）相似，但是显著高于朱九刚等［34］的研究结果（CK 组35.1 h）。玉米与燕麦青贮饲料中的黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮含量均低于饲料卫生标准关于黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的限量标准［35］。玉米青贮饲料中的黄曲霉毒素含量较多，这主要是因为黄曲霉等产黄曲霉毒素的真菌更容易感染玉米［36］。乳酸菌添加剂的使用能够有效降低玉米青贮饲料中的黄曲霉毒素B1 含量。这与付浩等［37］以及Guan 等［38］的研究结果相一致。

4 结论

玉米青贮饲料发酵品质优良。添加剂的使用尤其是PACA 和LAB+PACA 的使用提高了玉米青贮饲料的丙酸含量，显著提高了玉米青贮饲料中的淀粉和可溶性糖等非纤维碳水化合物的含量及有氧稳定性，降低了霉菌和酵母菌等有害微生物数量。LAB 及LAB+PACA 有效降低了黄曲霉毒素B1 的含量。添加剂的使用显著提高了燕麦青贮饲料的发酵品质，降低了氨态氮和丁酸含量，提高了粗蛋白含量，其中PACA 和LAB+PACA 效果较好。因此，添加剂尤其是LAB+PACA 的复合添加对于提高玉米和燕麦青贮饲料的青贮品质和安全性具有重要作用。