猪IFN-δ5的表达纯化及其抗PEDV感染的作用分析

宋诗莹，郭玮璐，夏学峰，张 雪，毕振威，张雪寒，范宝超，董海龙，李 彬

(1.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.江苏省农业科学院兽医研究所，南京 210014)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水为主要临床症状的病毒性疾病，对全世界养猪业的健康发展造成了严重威胁[1-2]。PEDV为单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，属冠状病毒科冠状病毒属，其可感染所有年龄段仔猪，对新生仔猪危害最大[3]。2010年，中国南方暴发严重PED疫情，造成了巨大的经济损失[4]，经病原学研究证实造成该疫情的元凶为PEDV变异株，与经典毒株相比，PEDV变异株致病性更强，可造成新生仔猪100%死亡[5-6]。目前虽已有商品化疫苗，但其效果并不理想，因此，研究有效的预防和抵抗PEDV变异株感染方法具有重要意义。

干扰素(interferons，IFNs)是抵御病毒感染的第一道防线，在抗病毒感染中发挥着重要作用。在抗病毒免疫应答中，IFNs的主要功能是诱导抗病毒蛋白的表达，并进一步激活抗病毒反应。通常，根据细胞表面受体结构的不同可将IFNs分为3个亚型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型IFNs包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ和IFN-ζ，在抗病毒免疫反应中起直接作用[7]；Ⅱ型IFN，即IFN-γ，由T淋巴细胞和自然杀伤细胞识别感染细胞而产生[8]；Ⅲ型IFNs包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，通过类似于Ⅰ型IFNs的独特受体复合物调节抗病毒免疫应答[9-10]。

针对PEDV的感染，目前研究主要集中于IFN-α和IFN-λ上，且相关研究发现，猪IFN-λ比IFN-α更能有效减少PEDV在肠上皮细胞中的感染，这可能与IFN-λ主要作用于黏膜上皮，在胃肠道黏膜感染中起关键作用有关[11-13]。而作为Ⅰ型IFNs的成员之一，IFN-δs于1993年由Lefevre等[14]首次发现，直到近年来Cochet等[15]通过基因组数据库筛选报道了数个IFN-δs不同亚型的相关序列，表明IFN-δs存在于众多偶蹄动物中，并在基因组中形成一个明显的簇。猪IFN-δs(pIFN-δs)共有11个功能基因，对猪不同组织中的IFN类型进行测定发现，pIFN-δs在猪肠道中大量表达[16]，但对其抗猪肠道病毒感染尤其抗PEDV感染的效果尚不清楚。试验前期研究中对PEDV感染后仔猪肠道进行了转录组分析，发现相较于其他IFN亚型，pIFN-δ5呈显著上调趋势。鉴于此，试验采用原核表达系统表达纯化了pIFN-δ5，并对其抗PEDV感染的效果进行了探究，以期为新抗PEDV药物的研发提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达质粒pET-32a(+)、Vero细胞、IPEC-J2细胞、牛胚胎肾细胞-MDBK、PEDV AH2012/12株、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)及PEDV-N蛋白鼠单克隆抗体均由江苏省农业科学院保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂盒Lipofectimine 3000、限制性内切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ均购自Thermo Fisher公司；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、Phanta Max Master Mix、HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和ChamQ SYBR qPCR Master Mix均购自Vazyme公司；His标签鼠单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)、BCA蛋白定量试剂盒及DAPI染料均购自碧云天生物技术公司；β-actin兔多克隆抗体、FITC标记山羊抗鼠IgG(H+L)均购自Proteintech公司；His纯化层析柱PurKine His-Tag Ni-NTA Packed Column购自武汉艾美捷科技有限公司；PD SpinTrap G-25脱盐柱购自Cytiva公司。其他常规试剂均为分析纯。

1.2 pIFN-δ5的扩增及其重组表达质粒的构建与鉴定

采用重组连接的方法获得包含pIFN-δ5的重组表达质粒。根据GenBank中pIFN-δ5基因序列(登录号：NM_001164854.1)设计重组引物：IFN-δ5-F：5′-GCGATATCCAATTCTCTGGGATCCA-TAGGTR-3′；IFN-δ5-R：5′-CGAAGCTTCAAGTG-TGCCTTTTTTCTCTCTT-3′，预计扩增长度为529 bp。

取10 g新鲜无菌猪肝脏组织(采自江苏淮安某生猪养殖场)进行研磨，使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2提取总RNA，采用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成cDNA，以其为模板扩增猪pIFN-δ5片段。PCR扩增体系50 μL：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min。

原核表达质粒pET-32a(+)经限制性内切酶EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ双酶切，胶回收获得线性化载体；按照重组酶说明书将pIFN-δ5片段与线性化pET-32a(+)载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液经PCR鉴定后挑取阳性克隆，使用EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ双酶切，并送南京擎科生物科技有限公司进行测序，重组质粒命名为pET-pIFNδ5。

1.3 pIFN-δ5的表达、纯化及鉴定

将重组质粒pET-pIFNδ5转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆菌于37 ℃培养，当D600 nm值达到0.5～0.6，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃恒温继续诱导培养4 h，离心收集菌体，低温条件下超声破碎，高速离心分别收集上清与沉淀，12.5% SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。取pET-pIFNδ5菌液扩大培养至4 L，离心收集菌体后，使用200 mL Buffer A(20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、5%甘油，pH 7.5)重悬，高压破碎3次，13 000 r/min离心30 min，取上清；按照His纯化层析柱PurKine His-Tag Ni-NTA Packed Column操作说明对上清进行纯化，使用Buffer A平衡，使用Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、250 mmol/L咪唑、5%甘油，pH 7.5)洗脱；使用PD SpinTrap G-25脱盐柱将洗脱样品脱盐至PBS中，获得纯化蛋白。纯化后的蛋白采用高效液相色谱(HPLC)检测纯度，条件为：SEC-HPLC柱；流动相为PBS；流速为0.5 mL/min；进样体积为10 μL；运行30 min。

纯化的pIFN-δ5蛋白经SDS-PAGE后转印至PVDF膜，以小鼠抗6×His标签抗体(1∶2 000稀释)为一抗、山羊抗鼠IgG-HRP(1∶10 000稀释)为二抗进行Western blotting鉴定。使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，-80 ℃保存备用。

1.4 pIFN-δ5的比活性测定

参考文献[17-18]，使用VSV/MDBK系统测定pIFN-δ5比活性。将MDBK细胞铺96孔培养板，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养至单层，设置不加pIFN-δ5和VSV空白对照、不加pIFN-δ5加VSV阳性对照、加pIFN-δ5不加VSV阴性对照；细胞使用D-Hank’s液清洗2次，用含2% FBS的DMEM将纯化的pIFN-δ5按照2×101、2×102、2×103、2×104、2×105、2×106稀释度进行倍比稀释，每孔加入倍比稀释的pIFN-δ5 100 μL，每个稀释度设5个重复，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养12 h；细胞用D-Hank’s液洗2次，每孔加入含100 TCID50的VSV溶液100 μL。以细胞病变效应作为判定结果，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养至空白对照组无细胞病变，阴性对照组无细胞病变，阳性对照组75%以上细胞出现病变时，计算pIFN-δ5比活性效价。

1.5 pIFN-δ5的细胞毒性测定

采用CCK8方法检测pIFN-δ5对细胞增殖的影响[19]。取IPEC-J2细胞铺96孔板，待长满单层，加入含不同浓度(10、50、100 ng/mL)pIFN-δ5的细胞维持液(含有2% FBS的DMEM)，并设立单独维持液对照(0 ng/mL)，37 ℃分别孵育4、8、12、16、24和36 h；吸弃维持液，加入100 μL含有10% CCK8试剂的新鲜培养基，继续孵育2 h，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。试验重复3次，使用测得样品与对照D450 nm值的比值进行结果判定。

1.6 pIFN-δ5的抗病毒检测

参考Zhang等[20]方法检测pIFN-δ5的抗病毒活性。取IPEC-J2细胞铺24孔板，待细胞汇合度至80%，加入含有不同浓度(0、5、10、50 ng/mL)的pIFN-δ5细胞维持液，继续培养12 h，进行预处理；吸弃维持液并使用无菌PBS洗涤3次，采用含100 TCID50PEDV变异株AH2012/12和5 μg/mL胰酶无血清培养基孵育细胞，37 ℃作用1 h，洗涤3次；加入含相同预处理浓度的pIFN-δ5、5 μg/mL胰酶无血清维持液，继续培养24 h，并按照相同处理方式设置无pIFN-δ5处理未接毒的对照组(NC)；接毒后24 h收取细胞上清样品，进行PEDV基因拷贝数的检测[19,21-22]；使用无水乙醇和蛋白裂解液分别固定和裂解细胞样品，进行PEDV N蛋白的间接免疫荧光、Western blotting测定及其蛋白灰度分析[19]，综合评价原核表达重组蛋白pIFN-δ5对PEDV的抗病毒效果。

1.7 统计分析

应用GraphPad Prism 6.0软件对测定后数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)及后续Tukey检验，结果以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 重组质粒pET-pIFNδ5的构建与鉴定

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在529 bp左右出现目的条带，与预期相符(图1A)。通过重组连接方法筛选获得重组质粒pET-pIFNδ5，经EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ双酶切获得片段大小分别约为5 900和529 bp(图1B)，与pET-32a(+)空载体质粒及目的条带大小一致。对重组质粒测序所获序列进行比对发现，与GenBank中pIFN-δ5序列(登录号：NM_001164854.1)一致，未发现突变。

M1，DL2000 DNA Marker；1，阴性对照；2，pIFN-δ5基因PCR扩增；3，pET-pIFNδ5双酶切鉴定；M2，1 kb plus DNA MarkerM1，DL2000 DNA Marker；1，Negative control；2，PCR amplification of pIFN-δ5 gene；3，Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-pIFNδ5；M2，1 kb plus DNA Marker图1 pIFN-δ5基因的PCR扩增(A)及重组质粒pET-pIFNδ5的双酶切鉴定(B)Fig.1 PCR amplification of pIFN-δ5 gene (A) and double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-pIFNδ5 (B)

2.2 pIFN-δ5蛋白的可溶性表达分析

将pET-pIFNδ5质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性菌落培养并诱导表达后，超声裂解获得菌体上清和包涵体，对其进行SDS-PAGE鉴定发现，pET-pIFNδ5诱导表达后上清中出现与预期大小(约35 ku)一致的蛋白条带(图2A)；进一步对菌体上清进行Western blotting检测发现，在约35 ku处出现特异性条带(图2B)。表明pET-pIFNδ5成功表达，且目的蛋白表达于上清。

①A，SDS-PAGE分析；B，Western blotting检测。②M，蛋白质分子质量标准；1，空载体诱导上清；2，空载体诱导沉淀；3，pET-pIFNδ5未诱导上清；4，pET-pIFNδ5未诱导沉淀；5，pET-pIFNδ5诱导上清；6，pET-pIFNδ5诱导沉淀；7、8，pET-pIFNδ5诱导上清样品①A，SDS-PAGE analysis；B，Western blotting detection.②M，Protein Marker；1，Supernatant of induced empty vector；2，Precipitate of induced empty vector；3，Supernatant non-induced of pET-pIFNδ5；4，Precipitate of non-induced pET-pIFNδ5；5，Supernatant of induced pET-pIFNδ5；6，Precipitate of induced pET-pIFNδ5；7 and 8，The induced supernatant samples of pET-pIFNδ5图2 重组质粒pET-pIFNδ5的诱导表达Fig.2 Induced expression of recombinant plasmid pET-pIFNδ5

2.3 pIFN-δ5蛋白的表达及纯化

由图3可知，洗脱样品中含有与预期大小一致的纯化目的蛋白，经浓度测定为1.0 mg/mL。经HPLC分析发现，目的蛋白纯度高达97.86%(图4)。

2.4 pIFN-δ5纯化蛋白的比活性测定

由表1可知，纯化的pIFN-δ5蛋白能有效抑制VSV对MDBK细胞的致病变，并表现出明显的抗VSV活性，病毒阳性对照组细胞病变效应超过75%，空白和阴性对照组无细胞病变效应；以抑制50%细胞病变的最高稀释倍数作为干扰素比活性，经计算，pIFN-δ5的干扰素比活性为5×104U/mg；依据纯化的pIFN-δ5质量浓度1.0 mg/mL，故pIFN-δ5的比活性为5×104U/mg。

图4 HPLC法检测pIFN-δ5蛋白纯度Fig.4 Determination of purity of pIFN-δ5 protein by HPLC method

表1 不同浓度pIFN-δ5对VSV的抑制效果

2.5 pIFN-δ5纯化蛋白的细胞毒性测定

采用CCK8方法检测pIFN-δ5蛋白对IPEC-J2细胞增殖能力的影响，结果见表2。由表2可知，与对照组IPEC-J2细胞相比，100 ng/mL pIFN-δ5作用36 h对IPEC-J2细胞的增殖能力有显著抑制作用(P<0.05)，表明较高浓度pIFN-δ5具有一定的细胞毒性作用。

表2 pIFN-δ5纯化蛋白对IPEC-J2细胞的毒性测定

2.6 pIFN-δ5抗PEDV感染的效果测定

采用不同浓度pIFN-δ5处理并测定其抗PEDV感染能力，结果显示，与0 ng/mL pIFN-δ5组相比，10和50 ng/mL pIFN-δ5组细胞上清中PEDV基因拷贝数显著或极显著降低(P<0.05；P<0.01)(图5A)。Western blotting及蛋白条带灰度比值结果显示，与0 ng/mL pIFN-δ5组相比，PEDV N蛋白表达量显著下调，其中10和50 ng/mL pIFN-δ5组分别存在显著差异和极显著降低(P<0.05；P<0.01)(图5B、5C)。间接免疫荧光结果显示，随着pIFN-δ5处理浓度的增加，PEDV阳性感染细胞数显著或极显著减少(P<0.05；P<0.01)(图6A、6B)。表明pIFN-δ5具有显著的抗PEDV感染的能力，且呈现剂量依赖性。

①A，PEDV基因拷贝数分析；B，Western blotting检测；C，蛋白条带灰度分析.②*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。下同①A，PEDV gene copy number analysis；B，Western blotting detection；C，Protein band gray scale analysis.②*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01).The same as below图5 病毒基因拷贝数及N蛋白表达量测定pIFN-δ5抗PEDV感染效果Fig.5 Theviral gene copy number and N protein expression assays of pIFN-δ5 against PEDV infection

A，间接免疫荧光分析；B，PEDV N蛋白表达阳性细胞数测定A，Immunofluorescence analysis；B，PEDV N protein expression positive cell number assay图6 免疫荧光测定pIFN-δ5抗PEDV感染效果Fig.6 The immunofluorescence assay detection of pIFN-δ5 against PEDV infection

3 讨 论

IFN作为最重要的一种先天性免疫分子，在抗病毒感染中发挥着重要作用。本研究采用原核表达系统表达并纯化了pIFN-δ5蛋白，并对其抗PEDV感染效果进行了初步的测定，发现pIFN-δ5在10 ng/mL低浓度作用下便具有显著的抑制PEDV感染能力，表现出较高的抗病毒活性。PEDV的靶器官为肠道，而Ⅲ型IFN-λ在肠道等黏膜感染中发挥着重要的作用。与Ⅰ型IFNs不同，Ⅲ型IFN-λ主要由上皮细胞、NK细胞和树突状细胞(DC)产生，且主要作用于黏膜上皮[10,23-24]，这些特征使IFN-λ成为抗局部黏膜感染的潜在候选药物[25]。而IFN-δs属于Ⅰ型IFNs，具有11个亚型[26]，不同亚型间抗病毒活性差异很大，如IFN-δ8具有抗伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒感染作用[20,27]。鉴于pIFN-δ5在PEDV感染的仔猪肠道组织中呈上调趋势，本研究选取该亚型IFN-δ进行了原核表达纯化及其抗PEDV感染作用分析。

IFN通过诱导下游的IFN刺激基因(ISG)的表达而发挥其抗病毒作用。研究发现，3种猪IFNs(IFN-α、IFN-λ1和IFN-λ3)均可引起IPEC-J2细胞中抗病毒基因ISG15、OASL、MxA和IFITM1的表达[28]。但是，不同的IFNs诱导ISGs的程度不同，如IFN-α更强烈地上调了IFITM1表达，而pIFN-λs诱导了更高水平的ISG15和MxA[13]。本研究使用纯化的pIFN-δ5孵育IPEC-J2细胞，对多种ISGs基因的表达进行了测定，初步发现Mx1、ISG15和OAS2等多个ISGs呈现显著上调趋势(数据未发表)，表明pIFN-δ5具有诱导多种ISGs的能力，但pIFN-δ5诱导ISGs发挥抗病毒作用是否与其他型IFNs存在不同，还需要进一步深入研究。

本试验发现，在pIFN-δ5蛋白表达条件的优化中，加入诱导剂IPTG诱导4 h后，pIFN-δ5蛋白大部分表达于上清中；而继续延长表达时间，虽然蛋白表达量会上升，但表达形式会变成包涵体。所以本研究采用诱导表达4 h后收集菌体，进行蛋白的纯化。IFN的比活性是反映其抗病毒效果的重要指标。先前的多项研究对猪的IFN-α和IFN-λ进行了原核、杆状病毒和酵母等不同形式的表达及纯化，测定的IFN比活性介于103～106U/mg之间[29-31]。本研究中pIFN-δ5的比活性为5×104U/mg，处于中间水平，且其蛋白纯度较高(97.86%)，难以通过提高纯度提升比活。但是该亚型IFN的肠道高表达特性及对PEDV的高抑制能力均表明，pIFN-δ5可能在抗猪腹泻相关病毒病中具有较好的应用前景。

4 结 论

本研究构建了pIFN-δ5的原核表达质粒，经诱导条件优化发现pIFN-δ5可表达于上清；经大量表达纯化获得纯度>95%的纯化蛋白，其比活性为5×104U/mg，且pIFN-δ5具有显著的抑制PEDV感染能力。