基于网络药理学与分子对接技术探讨桔梗元参汤治疗过敏性鼻炎的作用机制

申林强，章淑薇，邓鑫杰，靳陈丽芸，刘欣汝，刘碧源*

（湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208）

过敏性鼻炎（allergic rhinitis, AR）又称变应性鼻炎，全世界约有6 亿人患病且呈流行增加的趋势，欧美国家AR 的患病率为10%～40%[1]。我国近20 年成人和儿童AR 的流行都呈上升趋势，有研究报道，成人AR 的患病率为17.6%[2]。 AR 主要由IgE 介导的一种速发型超敏反应性疾病，临床表现为鼻塞、鼻痒、打喷嚏和流鼻涕等，其病因尚不完全清楚[3]。 目前，AR 的治疗方式以抗过敏药缓解症状为主，不能彻底治愈，复发率较高[4]。

中医药具有安全、毒副作用小和复发率低等优点，从而被广泛用于AR 的治疗[5]。 AR 在中医学归为“鼻鼽”范畴，临床以肺气虚寒证多见。 张仲景对本病有“清出”和“善嚏”的描述，认为寒邪收引、肺气不宣、津液不布则清出，阴阳互引、正邪相争则善嚏[6]。 桔梗元参汤出自清朝名医黄元御的《四圣心源》，全方由桔梗、元参、法半夏、茯苓、苦杏仁、陈皮、生姜和甘草8 味药组成，通过调理脾胃气机升降，使胃气降浊，脾气升清，补足正气，从而祛除外邪达到治疗AR 的目的[7]。其中，桔梗可开肺气、解毒排脓，元参润燥解毒，苦杏仁、橘皮清理肺气、化痰降逆，半夏和胃降逆，茯苓助升脾气去除水湿，甘草补脾胃，生姜散寒。临床应用桔梗元参汤治疗AR 可获得良好的治疗效果[8-10]，高健美等[11]对其作用机制进行了初步研究，发现桔梗元参汤能降低AR 小鼠鼻黏膜中p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和黏膜黏蛋白5AC（mucin 5AC, MUC5AC）的表达，通过调控p38MAPK/COX-2 信号转导途径而发挥作用。 但是尚未见桔梗元参汤治疗AR 的作用靶点及分子机制研究。

网络药理学是通过计算机软件和生物数据库，分析疾病的相关基因与药物靶点之间的生物网络关系，特别适用于中药及复方作用机制的研究[12]。由于桔梗元参汤组成成分复杂，治疗AR 的机制还未完全了解清楚。因此，本研究拟通过网络药理学探究桔梗元参汤的活性成分以及疾病的相关靶点，构建桔梗元参汤活性成分-靶点-AR 网络，探究桔梗元参汤治疗AR 的作用机制，为桔梗元参汤的临床应用及机制研究提供一定分子基础。

1 材料与方法

1.1 桔梗元参汤活性成分的检索

通过TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库分别以桔梗、元参、苦杏仁、陈皮、法半夏、茯苓、甘草和生姜为关键词检索桔梗元参汤的活性成分。参考药代动力学ADME 参数，以口服生物利用度口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、化合物类药性(drug likeness, DL)≥0.18 为条件进行药物活性成分的筛选[13]。

1.2 桔梗元参汤活性成分靶点和AR 靶点的预测

通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索到的活性成分2D 和3D 结构，导入pharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库预测活性成分的相关靶点。 通过OMIM（https://omim.org/）、NCBI Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库获取AR 相关靶点。将桔梗元参汤活性成分靶点与AR 疾病靶点相互映射，获得桔梗元参汤活性成分靶点-AR 疾病靶点。

1.3 桔梗元参汤靶点相互作用网络构建

将桔梗元参汤活性成分靶点-AR 疾病靶点导入STRING（https://STRING-db.org），得到蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network, PPI）。 将该蛋白质网络导入Cytoscape 3.8.1软件，采用Network analyzer 计算Degree 值，获得桔梗元参汤治疗AR 的关键靶点，构建桔梗元参汤-成分-靶点-AR 网络模型。通过Network Analyzer 软件对构建的网络模型进行深度分析。

1.4 桔梗元参汤治疗AR 功能和通路富集分析

将PPI 中的靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），对桔梗元参汤治疗AR 的相关靶点进行GO 富集和KEGG 通路富集分析，明确桔梗元参汤治疗AR的相关活性成分与靶点在细胞内发生反应的位置、涉及的分子功能和生物学过程。

1.5 分子对接

通过PubChem 数据库下载化合物3D 结构SDF格式，并利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于2.5A 的靶点的结晶复合式，采用Autodock Vina 软件进行分子对接，删除靶点内水分子，添加氢原子，抽取蛋白原配体，生成对接空腔。 运用PyMol 2.4.0对分子对接的结果进行可视化处理，通过观察对接亲和力得分来反映分子间结合的稳定性。

2 结果

2.1 桔梗元参汤活性成分筛选及靶点预测

通过TCMSP 数据库检索桔梗元参汤中的所有成分。获取桔梗元参汤含活性成分155 个，其中桔梗7 个、元参9 个、苦杏仁19 个、橘皮5 个、半夏13个、茯苓15 个、甘草92 个、生姜5 个，有11 个为共有活性成分。 根据桔梗元参汤活性成分进行作用靶点预测，删除冗杂和无靶点活性成分，筛选出98 个活性成分，对应靶点239 个。桔梗元参汤的主要活性成分见表1。

表1 桔梗元参汤治疗AR 的主要活性成分

2.2 AR 相关靶点的筛选

通过NCBI Gene、GeneCards 和OMIM 数据库获取AR 相关的靶点。 删除重复，得到AR 相关基因2206 个，再经UniProt 数据库进行转化。

续表1

2.3 桔梗元参汤活性成分-AR 疾病靶点的预测

将桔梗元参汤活性成分对应的239 个靶点与AR2206 个靶点相互映射，绘制韦恩图，得到共有靶点120 个。 详见图1。

图1 桔梗元参汤活性成分对应靶点-AR 相关靶点韦恩图

2.4 桔梗元参汤活性成分靶点-AR 靶点的PPI 网络

将桔梗元参汤活性成分所对应的239 个靶点基因与AR 相关的2206 个靶基因相互映射，得到120个共有靶点基因。将靶点基因导入STRING 数据库，构建PPI 网络，删除网络中断开连接的节点，并通过Cytoscape 3.8.1 将PPI 网络可视化，颜色深浅和形状大小与该基因在网络中的作用强弱呈正比，结果表明STAT3、JUN、MAPK1 和IL-6 等为桔梗元参汤治疗AR 的核心靶点。 详见图2。

图2 桔梗元参汤成分-AR 靶点的相互作用网络可视化

2.5 桔梗元参汤-成分-靶点-AR 网络构建

采用Cytoscape 3.8.1 软件进行网络分析，结果如图3 所示。 该网络中共有218 个节点（98 个成分节点和120 个靶点节点）和1398 条边。

图3 桔梗元参汤-活性成分-靶点-AR 网络

2.6 桔梗元参汤成分-AR 靶点的GO 功能富集分析

通过对桔梗元参汤活性成分-AR 靶点进行GO功能富集分析。 确定了2232 个GO 条目（P＜0.05）。其中，生物过程（Biological process, BP）主要涉及对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应和对抗生素的反应等2052 个；细胞组成（cellular component,CC）主要包括膜筏、膜微区和膜区等52 个；分子功能（molecular function, MF）主要涉及细胞因子活性、细胞因子受体结合和核受体活性等128 个。 根据P 值大小筛选出排名前10 位的功能分析，详见图4。

2.7 桔梗元参汤活性成分-疾病靶点的KEGG 通路富集分析

通过对桔梗元参汤活性成分-AR 靶点进行KEGG 通路富集分析。限定P＜0.05，获得165 条富集结果。 根据P 值的大小得到排名前20 的代谢通路，包括AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、PI3K-Akt 等通路。 详见图5-6。

图5 桔梗元参汤活性成分-AR 靶点KEGG 通路分析

2.8 分子对接分析

将桔梗元参汤中几味重要中药的主要成分β谷甾醇、茯苓酸、橙皮苷和姜醇与核心靶点的对接结果通过PyMol 进行可视化处理，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好。 详见表2、图7。

图7 桔梗元参汤中活性成分与关键靶点分子对接的可视化图

表2 桔梗元参汤中活性成分与关键靶点的分子对接结合能（kcal·mol-1）

3 讨论

近年来，随着环境条件和生活方式的改变，AR发病率不断升高[14]。 中医学将该病归属于“鼻鼽”范畴，认为与脾、肺和肾相关，肺气虚弱，卫表不固，风寒袭肺，鼻窍堵塞，则出现鼻鼽。一般采用祛风解表、温肺益气和宣通鼻窍等治疗为主[15]。 《严氏济生方》中描述：“鼻者，肺之所主，职司清化，调适得宜。”肺通窍于鼻，调节气的升降出入。 而鼻为肺之门户，气机借鼻腔出入。 外感邪气，由鼻入肺，出现鼻窍不利，肺金不清，宣降失常，导致气机出入不畅。 桔梗元参汤治疗流清鼻涕的AR，通过升降气机，去除寒邪，调理脾胃气机升降，调畅肺气，使得正气得以伸张[7]。

图6 桔梗元参汤活性成分-AR 靶点KEGG 部分通路图

本研究应用网络药理学对桔梗元参汤进行分析，发现有98 个活性成分。其中，槲皮素属于黄酮类化合物，具有抗过敏、抗氧化和免疫调节等多种生物学功能[16]。研究发现，AR 患者鼻黏膜受感觉神经、交感神经和副交感神经的支配，受到外界变应原刺激后，感觉神经能产生P 物质（substance P, SP）和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）等神经肽，刺激鼻黏膜的血管扩张、水肿并激活炎症细胞，促进AR 的发生发展[17]。 KASHIWABARA 等[18]发现，槲皮素可减轻致敏大鼠鼻神经源性炎症和过敏样症状，可能是通过抑制细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2, ERK1/2）和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路，降低SP 和CGRP 等神经肽的水平。 另有研究发现SP 和CGRP 降低可抑制巨噬细胞的活化，减少IL-1β、IL-3 和TNF-α 等促炎性细胞因子的产生，抑制鼻过敏样症状的发展[19]。 TANAKA 等[20]报道槲皮素在体外可抑制IL-4 诱导的CD4+T 细胞产生IL-5和IL-13，调节Th1/Th2 细胞因子平衡，达到治疗过敏性疾病包括AR 的目的。 高健美等[21]用桔梗元参汤治疗AR 小鼠，发现血清中Th1 型细胞因子（IFN-γ 和IL-2）含量明显升高，Th2 型细胞因子（IL-4 和IL-10）降低。 因此，桔梗元参汤中的槲皮素可调节机体的免疫功能，保持Th1/Th2 平衡，在AR 的治疗过程中可能发挥重要的作用。 木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，具有良好的抗过敏作用。 通过尘螨致敏建立AR 小鼠模型，发现木犀草素可抑制该模型小鼠中pSTAT6 和GATA3 表达，减少分泌IL-4 的脾细胞数量，降低血清特异性IgE 水平，减少嗜酸性粒细胞浸润和小鼠鼻上皮粘液分泌，有效减轻AR的症状[22]。 黄芩素也是一种有效抗过敏的黄酮类化合物，有研究发现其能减轻AR 小鼠的组织学改变、异常组织修复和炎症反应，抑制血液和鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎症细胞因子的产生，同时减少嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的浸润，其机制是减少STAT3 磷酸化和调节核的转位[23]。 郑永艳等[24]发现儿茶素可明显抑制组胺所致肠管收缩，提示儿茶素是抗过敏作用的重要活性物质。另有研究发现，儿茶素可有效减轻AR 的症状，其机制是通过NF-κB/TSLP 途径抑制胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP）的表达，降低血清中IL-5、IL-13 和IgE 的水平，调节Th1/Th2免疫平衡[25]。

桔梗元参汤与AR 相互作用的靶点基因功能富集分析显示，绝大部分功能富集在信号传导中，主要涉及AGE-RAGE、IL-17、T 细胞受体信号通路、MAPK 信号通路、TNF、C 型凝集素受体和HIF-1α等信号通路，其中IL-17 信号通路在AR 的发病中可能起着比较重要的作用。 有研究发现，AR 患者的血清IL-17 水平明显高于正常人[26]。 从AR 患者的外周血单个核细胞中去除Th17 细胞后，IgE 水平降低，而加入重组IL-17 后可恢复IgE 水平。 同时，与正常对照组相比，IL-17 可促进AR 患者B 细胞产生IgE[27]。 有研究发现，AR 患者鼻黏膜中的抗原提呈细胞能向初始T 淋巴细胞递呈过敏原，导致效应性T 淋巴细胞的分化、产生Th2 型细胞因子和抗原特异性IgE。 其中， 调节性T 细胞（regulatory T cells,Tregs）可抑制细胞因子的分泌，维持免疫耐受[28]。PALOMARES 等[29]发现Tregs 能够抑制IgE 的产生，对于健康免疫应答和免疫耐受的产生必不可少。AKDI 等[30]研究报道过敏人群中过敏原特异性Tregs数量显著减少。上述均提示，桔梗元参汤中的有效活性成分可能通过调节T 受体细胞通路，诱导T 淋巴细胞向Tregs 分化，从而抑制IgE 的分泌，防治AR的发生发展。

高健美等[11]研究发现桔梗元参汤能够显著改善AR 模型小鼠的症状，降低血清IgE 水平。同时，显著降低了模型小鼠鼻黏膜中p38MAPK、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和MUC5AC 的蛋白表达，表明桔梗元参汤可通过p38MAPK/COX-2 信号通路调节MUC5AC 的表达而发挥治疗AR 作用。 本研究也发现，MAPK 信号通路是桔梗元参汤治疗AR的关键信号通路。

综上所述，本研究采用网络药理学对桔梗元参汤治疗AR 的作用机制进行了初步分析，发现桔梗元参汤活性成分-疾病靶点分析显示活性成分通过多条信号通路发挥作用。 这些结果表明桔梗元参汤是通过多成分-多靶点-多途径发挥治疗AR 的作用，活性成分与信号通路的相互作用为下一步研究提供了方向。