基于UF1000i尿沉渣分析仪对Clinitek Atlas尿干化学分析仪白细胞计数与反射率的关系研究及思考

张洪波,张 辉,黄 铭,陈 星，李 果

（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉 430030）

根据《医学实验室质量和能力认可准则》质量要求（简称ISO15189）[1-2]，实验室需要每年两次对尿液化学试纸分析仪进行设备校准，就像尿沉渣分析仪一样，以符合中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的要求[3]。校准完成后，需要进行校准验证，通常校准由授权的主管工程师进行，实验室人员可以完成校准验证。针对尿干化学分析仪而言，因其为定性导致其校准存在着一定的盲区，细节上也不符合质量体系的要求，迫切需要尿干化学分析仪由定性向定量方向发展，因此以本文此前一篇红细胞和反射率的研究为基础，验证了白细胞计数(WBC 计数)与其反射率之间的关系，解析出其定量关系曲线，逐步验证了尿干化学分析仪定量的可行性，从而有助于优化尿干化学分析仪的校准流程，也为尿干化学分析仪各指标定量化进程奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验标本 UF1000i 尿沉渣分析仪白细胞计数＞1 000/μl，配以人工镜检确认，无上皮细胞，无结晶黏液丝干扰，其它结果无异常的尿标本。

1.2 仪器和试剂 UF1000i 尿沉渣分析仪（日本）及其原装配套试剂；西门子Clinitek Atlas 自动尿液化学分析仪（ 德国 ）及其配套试剂，室内质控采用伯乐的尿干化学质控品。湖北省室间质评、卫生部室间质评、以及2020年进行的美国病理学家协会(CAP)质量评价结果合格。

1.3 方法

1.3.1 获得合格的尿标本，在200×g 离心5 min，轻轻吸弃上清尿液，加入生理盐水洗涤，再在200×g 离心5 min，轻轻吸弃上清液，再加入生理盐水，再离心弃上清，反复3 次。

1.3.2 将洗涤好的标本加生理盐水配制成10 ml 的样本备用，样本分别在Clinitek Atlas 自动尿液化学分析仪和UF1000i 尿沉渣分析仪上检测，然后补足生理盐水至10 ml，再检测，重复上述过程，直至尿干化学检测白细胞脂酶（Leucocyte 1lipase, LEU）为阴性为止。尿干化学分析仪完成一次检测需要0.6 ml 样本，尿沉渣分析仪完成一次检测需要0.8 ml样本，即对样本进行等比稀释（q=0.86）的连续检测。1.3.3 配制好的标本需要在1h 内完成标本的检测[4-5]，记录干化学白细胞反射率的值和尿沉渣对应的白细胞计数值。

1.4 统计学分析 通过GraphPadPrism8 统计分析程序确定白细胞计数与反射率之间的关系，并通过KAPPA 检验确定WBC 定性分级的反射率临界点(即阴性、微量和1+，2+，3+对应的反射率临界值）。

2 结果

图1 白细胞计数和反射率关系曲线图

2.1 建立白细胞计数和反射率关系曲线 见图1。按1.3 方法构建白细胞计数(X)和反射率(Y)之间的关系。在上述分析的同时，对原始尿液样本进行Wright-Giemsa 染色后进行分类。在这份尿液标本中，中性粒细胞占白细胞总数的86%，淋巴细胞占5%，单核细胞占9%。由于UF1000i 检测的是所有的白细胞，而干化学检测的仅为中性粒细胞，所以对上述曲线进行了修正，修正后的关系曲线为：Y=109.14ln(X)+931.94。

2.2 定性等级的反射率临界点验证 见表1。与Clinitek Atlas 自动尿液化学分析仪的浓度等级（阴性、微量、1+，2+，3+）相对应的反射率临界点取决于仪器的设定，此处我们只能通过验证的方式来获取实际的浓度等级反射率临界点。为此我们选择了8 例患者标本，共计测试187 条有效数据点，并结合Kappa 检验，确定各等级的临界反射率。

表1 临界点反射率及Kappa 值统计表

2.3 基于反射率的白细胞临界点验证 见表2。通过将临界反射率值代入白细胞计数与反射率的关系曲线（即3.1 节得到的关系曲线），可以得到白细胞临界点的验证浓度。

表2 反射率对应的白细胞浓度（个/μl）

3 讨论

3.1 选择标本 本实验在白细胞的制备上未能延续此前对红细胞进行验证时采用的梯度浓度的方法[6]，是因为在对白细胞进行盐水洗涤时，细胞丢失不容易控制。因此，改进采用了洗涤后等比稀释的模式。也就是说，对于10ml 制备好的标本，完成尿干化学检测需要0.6ml，尿沉渣检测需要0.8ml，共计1.4 ml，一次检测完成剩余8.6 ml，再补足生理盐水至10ml，进行下一次检测，即整个过程采取以q=0.86 的等比稀释模式。

同时，在选择尿白细胞计数大于1 000/μl 的标本时，瑞氏-吉姆萨染色镜检排除因退变或巨噬细胞较多时对中性脂酶检测的影响，基于此门诊标本更合适，因为门诊标本急性感染的可能性较大，白细胞在尿路中停留时间相对较短，使溶解和变性的可能性降低。所以此次标本主要来源于门诊证实的尿路感染，但同时细菌感染也要被去除，特别是高上皮细胞标本[7]，以排除上皮细胞的干扰。

在对白细胞进行离心洗涤时，应采取低速离心（实际将离心力由400g 降为200g），以排除因高速离心对白细胞进行解聚洗涤时造成的白细胞破裂导致脂酶释放（即离心力越高，解聚难度越大），整个过程对标本的处理要轻，以避免白细胞被破坏导致中性脂肪酶溢出进而影响尿液化学分析仪的检测。

事实上，我们也使用过细胞分离方法来获得高纯度的中性粒细胞，如使用solarbio 和TBD 品牌的人外周血中性粒细胞分离液来分离全血细胞中的中性粒细胞，但有其局限性。分离成功率不高，相同的分离条件分离全血的重复性不好，研究发现可能与全血的红细胞平均体积有关：平均红细胞体积越大，离心力越大，其他条件不变时分层效果越好。此外，即使分离中性粒细胞，如一些论文报道，分离液可以显著分层细胞[8-9]，却没有适当的方法将分离层中的中性粒细胞有效的剥离（将中性粒细胞剥离出来又不带淋巴细胞和单核细胞），因此本研究未采用全血白细胞分离法。

同时需要说明的是，此处用UF1000i 替代金标准的手工方法来计数白细胞，是因为UF1000i 尿沉渣分析仪的性能符合要求，同时其对白细胞计数相对手工方便快捷，最现实的问题是尿干化学搭配尿沉渣对尿液进行检测符合日常实际工作流程[10-13]。

3.2 白细胞临界值浓度的解释 从表2 中，白细胞计数的临界浓度验证与操作手册中给出的值之间存在差异。这就需要我们对尿液化学试纸分析仪的校准进行反思。对于UF1000i 尿沉渣分析仪，每6 个月对设备进行校准，在Clinitek Atlas 自动化尿液化学分析仪的报告中只给出了每个指标的校准范围，没有给出标准浓度白细胞对应的反射率值。如Clinitek Atlas 自动尿液化学分析仪校准报告所示，白细胞的反射率相对较宽，范围为949 ～1 088，根据此范围计算出WBC 反射率的变异系数约为2%，而中华人民共和国行业标准YYT0475-2011 尿干化学分析仪第3.2 节描述的重复性表明，尿干化学分析仪反射率测试结果的变异系数，即CV值应不大于1%[14-15]，从这个角度来讲，此设备的校准报告是不符合要求的。而白细胞计数和反射率曲线的建立，构建修正后的关系曲线为：Y=109.14ln(X)+931.94，此关系曲线从计算方法上虽与先前报道的不同[16]，但方向一致同为对数曲线，这将有助于尿干化学分析仪由定性向定量方向改进，再利用标准浓度的校准品对设备进行校准并能有力的弥补现行的尿干化学分析仪设备校准环节的不足。

3.3 尿干化学分析仪在定量开发中的优势

3.3.1 精细尿干化学分析仪的校准：尿液化学分析仪向定量转化后，检测值可由间断型向连续型转化，以此有效弥补目前尿液化学分析仪在校准过程中存在的不足，定量改进已有相关文献报道[17]。同时设计出定量尿干化学分析仪的定值校准品对设备进行校准，犹如目前用定值校准品对UF1000i 进行校准一样，可以更容易检测设备单元老化等问题，从而更好地提醒工程师准确调整激光单元的相关参数，将设备的状态调整至最佳。

3.3.2 定量研发的边际成本低：针对各尿干化学制造商而言，目前所要做的工作只需要将尿十项(隐血、白细胞、亚硝酸盐、比重、pH、蛋白质、葡萄糖、酮体、尿胆原、胆红素)的关系曲线或者说拟合曲线植入到设备中，再设计出相应的可视化界面将各项目的检测值呈现给客户就好。尿干化学分析仪在近20年技术革新不明显，不寻求改变在日新月异的今天有被市场淘汰的风险，现在设备生产商只需要对设备软件进行适当调整，给用户提供以反射率为基础的定量服务，在几乎不需要投入新的研发成本的基础上就能给用户新的价值的体验。

3.3.3 临床需求：定量改进能更准确地反映病人的病情，在对医生对尿常规的关注度调查中，当问及“参考尿常规在你的疾病领域的诊断中所占的比例是多少？”时，参考比例仅在0 ～25%之间，根本原因可能是尿常规给临床提供的信息太少，目前尿干化学结果全部阴性对临床意义更显著，也就是特异度作用更显著。从这个角度来看，尿液化学分析仪从定性到定量的发展也符合临床需要,以充分发挥尿干化学的作用[18]。举一个简单的例子，在白细胞定性结果同在3+时，如果做到了定量改进，定量结果更能反映出患者病情的细微变化。

3.3.4 更及时的报告：关于报告的时间有效性，门诊患者尿干化学分析的TAT 时间（turn around time）为40 min，本实验对应的尿生化TAT 时间为3h。尿干化学分析的定量改进能将TAT 时间由3h缩短为40min。这对确诊后治疗监测的患者是省时又经济的。

3.3.5 双赢的局面：事实上按照3.3.3，设备制造商和用户是双赢的，设备制造商为用户提供了一个可视化的定量界面，用户可以以此为基础在白细胞领域开发新的检测指标，用反射率定量检测白细胞中性脂肪酶浓度，结合尿沉渣分析仪白细胞计数，我们可以得到一个新的检测指标：平均白细胞脂酶含量，这个指标将有助于尿路感染的诊断，因为从理论上，尿路感染会使更多的白细胞吞噬细菌自溶、中性脂酶释放，同时有形白细胞减少，从而使平均白细胞脂酶含量的值增加。这一理论的证实取决于设备制造商对设备的定量改进。

基于上述，尿干化学分析仪应在现有的基础上加以改进，逐步向定量方向发展，以适应实验室质量体系发展的需要，以更好地为临床服务。更重要的是，定量改进对设备商、用户及患者都是有益的。