弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中miR-448和KDM2B的水平表达及临床意义

陈思言，张伶莉，杨丽华

(达州市中心医院血液内科，四川达州 635000)

弥漫性大B 细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是常见的恶性淋巴瘤之一，为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)的一个亚型，DLBCL 临床表现多样、复杂，具有高异质性，目前对DLBCL 的治愈率有很大提高，但仍有30%～40%的患者出现耐药和复发，因此，寻找有效标志物对DLBCL 的诊断、治疗和预后评估具有重要价值[1-2]。微小核糖核酸（miroRNA，miRNA）是一类内源性小分子，参与恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等多种生物学行为，研究表明，miRNA 在DLBCL 等多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，可作为肿瘤的生物标志物[3-4]。如歧红阳等[5]研究表明，在结肠癌细胞SW480中，过表达hsa-miR-448 通过下调缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α) 可减弱细胞的侵袭、迁移能力及抑制SW480 上皮间质转化，从而抑制结肠癌的发生和发展。赖氨酸特异性脱甲基酶 2B[lysine(K)-specific demethylase 2B，KDM2B]是一种去甲基化酶，主要通过调节组蛋白的甲基化状态发挥生物学作用，在细胞增殖、分化、肿瘤的发生中起重要作用[6]。研究表明，胃癌患者胃癌组织中KDM2B 表达水平明显升高，且与患者组织分型、淋巴结状态、TNM 分期和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HeR 2）及患者预后相关[7]。miR-448, KDM2B在DLBCL 中的表达尚未见报道。本研究检测miR-448, KDM2B mRNA 及蛋白在DLBCL 组织中表达情况，分析其与患者临床特征之间的关联，探讨miR-448, KDM2B 在DLBCL 发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2016年7月～2018年3月在达州市中心医院收治的DLBCL 患者97 例，其中男性59 例，女性38 例，患者年龄41～78（59.80±9.50）岁。纳入标准：①符合DLBCL 的诊断标准[8]；②经活检组织病理学确诊；③临床病理资料及随访资料完整。排除标准: ①并发其他器官或系统恶性肿瘤患者；②临床资料不全者。应用 Hans 法则对DLBCL 患者进行分型，其中GCB（germinal center B cell）型55 例，non-GCB 型42 例。Ann Arbor 分期:Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。国际预后指数(International prognostic index，IPI) 评分:0 ～2分50 例，3 ～4 分47 例；东部肿瘤协作组（Eastern cooperative oncology group, ECOG）评分＜2 分43例，≥2 分54 例。有B 症状46 例，无B 症状51 例。血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常60 例，升高37 例。

选取同期50 例淋巴结反应性增生组织(reactive hyperplasia of lymph node，RHL)患者为对照组，其中男性28 例，女性22 例，年龄 38 ～79 (59.40±9.70)岁。两组观察对象之间年龄、性别等资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

研究样本采集均经过本院伦理委员会批准，患者或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂（美国Invitrogen Life Technologies 公司）；反转录试剂盒，real-time PCR 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；兔抗人KDM2B 多克隆抗体（美国Elabscience）；免疫组化试剂盒，羊抗兔二抗（上海碧云天生物科技有限公司）；miR-448, KDM2B 和内参基因引物均由上海生工生物公司设计与合成。罗氏480 定量PCR 系统（德国Roche 公司）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测miR-448, KDM2B mRNA 的表达：分别取DLBCL 组织与RHL 组织，研钵研碎后，Trizol 试剂提取总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，采用qRT-PCR 检测miR-448, KDM2B mRNA 水平。miR-448, KDM2B 和内参基因U6, β-action 基因序列设计引物，由上海生物工程公司合成，引物序列见表1，反应结束后，miR-448, KDM2B 相对表达水平采用2-ΔΔCt分析法计算。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.2 免疫组织化学染色检测KDM2B 蛋白：Envision 两步法对石蜡切片进行染色。将包埋DLBCL 组织及RHL 组织的石蜡标本切成3μm 的切片后，经过脱蜡、修复后，加10g/dl 山羊血清封闭，兔抗人KDM2B 多克隆抗体（稀释倍数1 ∶100），室温孵育1h，PBS 洗涤后，加羊抗兔二抗（稀释浓度1 ∶500），孵育后显色。染色结果判断：随机取5 个高倍视野，对细胞进行计数。①根据阳性细胞数：阳性细胞≤5%，0 分；6%～25%，1 分；26%～50% 2 分；51%～75%，3 分；＞75%，4 分。②根据细胞染色强度评分：无染色为0 分，淡黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分。将两项评分相乘作为评判标准：得分0 ～1 分为KDM2B 阴性表达，2 分以上为KDM2B 阳性。

1.3.3 随访：对所有DLBCL 患者进行电话或门诊随访，每3 个月随访一次，共随访36 个月，末次随访时间为2020年3月31日，记录患者生存情况，计算三年总生存率。

1.4 统计学分析 利用SPSS 22.0 进行统计学分析，采用t检验分析对照组和DLBCL 组miR-448，KDM2B mRNA 表达水平的差异，用卡方检验和独立样本t检验分析不同DLBC 患者miR-448,KDM2B 表达与临床病理特征关系，Kaplan-Meier生存分析miR-448, KDM2B 表达与DLBCL 患者生存率的关系，Pearson 分析miR-448, KDM2B 表达水平相关性，COX 回归模型分析影响DLBCL 患者预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象DLBCL 患者组织中miR-448，KDM2B 表达水平比较 DLBCL 患者组织中miR-448 表达水平显著低于对照组（0.65±0.08 vs 1.04±0.19），而KDM2B mRNA 表达水平显著高

于对照组(2.89±0.54 vs 0.98±0.21)，差异均有统计学意义（t=17.473, 24.058, 均P＜0.001）。

2.2 两组研究对象DLBCL 组织中KDM2B 蛋白表达水平比较 见图1。免疫组织化学染色结果显示，KDM2B 表达主要定位于细胞核，对照组阳性表达11例（22.00%），DLBCL组阳性表达70例（72.16%），DLBCL 组KDM2B 蛋白阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义（χ2=33.561，P＜0.001）。

图1 KDM2B 蛋白在DLBCL 组织中阳性表达（×400）

2.3 miR-448，KDM2B 表达水平与临床病理特征的关系 见表2。以DLBCL 组织中miR-448,KDM2B 蛋白阳性表达情况，将DLBCL 患者分为miR-448 高表达组（ ≥0.65）, miR-448 低表达组（＜0.65）和KDM2B 阳性表达组, KDM2B阴性表达组。分析发现miR-448，KDM2B 表达与Ann Arbor 分期、IPI 评分、Hans 分型有关（χ2=4.227 ～12.960，均P＜0.05）；与年龄、性别、LDH 水平、ECOG 评分、有无B 症状无关（χ2=0.072 ～3.726，均P＞0.05）。

2.4 DLBCL 患者组织中miR-448 与KDM2B 表达水平的相关性 见图2。DLBCL 患者组织中miR-448 与KDM2B 表达水平呈负相关（r=-0.602，P＜0.01）。

表2 miR-448，KDM2B 表达水平与DLBCL 临床病理特征的关系

图2 DLBCL 患者组织中miR-448 与KDM2B表达水平相关性

2.5 miR-448, KDM2B 表达与DLBCL 患者生存率的关系 见图3。通过Kaplan-Meier 生存分析可知，miR-448 高表达组DLBCL 患者三年累积生存率显著高于miR-448 低表达组患者（55.53% vs 31.38%），差异有统计学意义（χ2=7.434，P=0.006）。KDM2B阳性表达组DLBCL 患者三年累积生存率显著低于阴性表达组患者（31.73% vs 56.67%），差异有统计学意义（χ2=8.877，P=0.006）。

2.6 DLBCL 患者预后影响因素分析 见表3。单因素分析结果显示，Ann Arbor 分期、IPI 评分、Hans 法分型、miR-448，KDM2B 是影响DLBCL患者不良预后的危险因素。多因素分析结果显示，Ann Arbor 分期（95%CI=1.567～4.012，P=0.005）,miR-448（95%CI=2.213～4.478，P=0.001）, KDM2B（95%CI=1.506～4.554，P=0.003）是影响DLBCL 患者不良预后的独立危险因素。

图3 miR-448, KDM2B 表达与DLBCL 患者生存率的Kaplan-Meier 生存分析

表3 影响DLBCL 患者不良预后的危险因素分析结果

3 讨论

miR-448 在多种肿瘤组织或细胞中低表达，发挥抑癌基因的作用，miR-448 与细胞免疫应答、细胞增殖、凋亡、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和肿瘤细胞耐药密切相关[9]。多项研究表明，miR-448 在结肠癌、膀胱癌、肺癌和口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[10-11]。研究表明，miR-448 在乳腺癌组织和细胞中表达下调，通过靶向E 盒结合锌指蛋白(ZEB)1/2 抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和EMT[12]。另有研究[11]显示，与正常组织相比，非小细胞肺癌（NSCLC）组织中miR-448 水平降低，过表达miR-448 可降低细胞的生长和迁移能力，抑制EMT，影响EMT 相关分子波形蛋白和E-cadherin的表达，miR-448 有希望成为NSCLC 患者的治疗靶点。本研究结果显示，与对照组比较，DLBCL组织中miR-448 表达水平降低，且其表达水平与DLBCL的Ann Arbor分期、IPI评分、Hans分型有关，推测miR-448 在DLBCL 的发生发展中发挥作用。SHAN 等[13]研究表明，miR-448 在肺鳞状细胞癌组织和细胞系中的表达降低，miR-448 的表达与肺鳞癌的分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、临床分期及预后相关，本研究结果与此类似。JIN等[14]人研究表明，胰腺癌组织和细胞系中miR-448表达水平降低，过表达miR-448 导致G0/G1 细胞周期停滞，显著降低癌细胞增殖并促进癌细胞的凋亡，表明miR-448 发挥抑癌基因的作用，低表达可促进肿瘤生长，本研究中miR-448 在DLBCL 中低表达，推测miR-448 也是发挥抑癌基因的作用。

KDM2B 在调节细胞生长、增殖、分化、迁移及炎症反应、免疫调节等多方面发挥重要作用[15]。多项研究结果表明，KDM2B 在乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞中高表达，其被认为是一种致癌基因[16]。有研究表明，胰腺导管腺癌（PDAC）中KDM2B 高表达，可促进胰腺癌的进展，沉默KDM2B 表达使PDAC 细胞丧失上皮分化能力，敲除KDM2B 的表达可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞自噬[17-18]。本研究结果显示，DLBCL 组织中KDM2B mRNA 及蛋白阳性表达率显著高于对照组，且其表达水平与DLBCL 患者的Ann Arbor 分期、IPI 评分、Hans 分型有关，提示KDM2B 与DLBCL 的发生发展有关。易叶叶等[19]研究表明，卵巢恶性肿瘤组织中KDM2B 蛋白表达水平升高，与卵巢癌低分化、国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) 分期和淋巴结转移有关，此研究结果与本研究在DLBCL 结果类似，表明KDM2B 参与了DLBCL 的进展过程，促进DLBCL 的发生发展。

另外，本研究结果显示，DLBCL 组织中miR-448 与KDM2B 表达水平呈负相关，提示两者在DLBCL的发生发展过程中可能具有负向调控作用。研究表明，miR-448 通过下调KDM2B 的表达，刺激糖酵解并促进胃癌细胞的增殖[20]。本研究也通过查询targetscan 数据库发现，miR-448 与KDM2B存在靶向关系，因此本研究推测，miR-448 可能通过下调KDM2B 的表达，参与DLBCL 的发生发展。有研究显示，miR-448 与口腔鳞状细胞癌患者的预后相关，KDM2B 与胶质瘤患者预后有关[21-22]，本研究分析结果显示，miR-448 高表达组DLBCL患者三年累积生存率显著高于miR-448 低表达组患者，KDM2B 阳性表达组DLBCL 患者三年累积生存率显著低于阴性表达组患者，提示miR-448,KDM2B 表达水平可能通过调控肿瘤发展影响患者预后情况。COX 回归分析结果显示，miR-448,KDM2B 是影响DLBCL 患者不良预后的独立危险因素，提示miR-448, KDM2B 可作为评估DLBCL患者不良预后的标志物。

综上所述，在DLBCL 患者组织中miR-448 低表达、KDM2B 高表达，二者与DLBCL 临床病理特征和患者预后有关，可作为DLBCL 患者潜在的预后标志物。但二者在DLBCL 中具体作用机制需要从细胞和分子层面做进一步研究。