肾移植术后急性T 细胞介导的排斥反应外周血中miRNA 特异性表达谱筛选

徐 亮，陈秀秀，徐 剑，甘惠玲，蒋鸿涛

（海南医学院第二附属医院，海南海口 570100）

如何早期识别肾移植术后急性排斥反应（acute rejection，AR），并且在移植肾未发生损害或轻微损害时给予及时、最佳的治疗被认为是提高移植肾存活率的关键［1］。因此，如何在AR 造成移植肾不可逆损伤之前早期发现AR 是目前面临的严峻问题。有研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）参与调控移植肾AR，其发生时间不仅先于临床症状，更先于病理改变［2，3］。而急性TCMR 是AR 常见的临床类型，约占90%［4］。本研究通过二代测序的方法筛选出肾移植术后发生急性TCMR 中显著差异表达的miRNA 并探讨其可能的机制，以期寻找外周血中可稳定检测到、与肾移植AR 发生密切相关的miRNA 作为早期诊断急性TCMR 的新型生物学标记物，为肾移植术后急性TCMR 的早期诊断和治疗提供新的更有力的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院肾移植科2019 年8 月1 日～2020 年12月31 日行同种异体肾移植术的受者8 例，其中男性6 例，女性2 例，年龄29～53 岁，平均年龄41.2 岁，群体反应性抗体、淋巴毒试验均为阴性，术后均使用他克莫司+麦考酚肠溶片+甲泼尼龙三联抗排斥治疗。其中实验组和对照组各4 例。实验组均行移植肾活检穿刺证实为TCMR，对照组为同期肾移植术后恢复良好、肾功能稳定的受者。两组年龄、性别、BMI 比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。实验组诊断为TCMR 后均使用激素或者兔抗人胸腺免疫球蛋白治疗，且治疗后血肌酐均恢复至发生TCMR 之前的水平，复查移植肾彩超均未发现明显异常。本研究获得了医院伦理委员会的批准，且参与本研究的受者均签署了知情同意书。

1.2 方法

抽取研究对象30 mL 肘静脉血分别装入3 支内含肝素钠抗凝剂的采血管中，2 000 r/min 离心得到PBMC。用TRIzol 试剂提取标本的总RNA，RNA质量控制标准为：（1）260/280 比值≥1.80、260/230比值≥1.8；（2）RNA 总量＞100 ng；（3）RNA 完整度检测28S/18S＞1.5、RNA Integrity Number（RIN）＞7。笔者将用干冰保存的总RNA 通过冷链寄送到上海生工生物，其采用二代测序的方法得到样本的原始数据后用R 语言软件进行差异性分析。为了得到显著差异的基因，将筛选条件设为：P≤0.05且差异倍数≥2。

1.3 统计学处理

对于无生物学重复的样本，先采用TNM 对read count（读长数目）数据进行标准化处理，之后用R 语言edgeR 包进行差异分析。对有生物学重复的样本，采用R 语言DESeq2 包进行分析。为了得到显著差异的基因，将筛选条件设为：P≤0.05 且差异倍数≥2。利用R 软件绘制差异基因MA 图和差异miRNA 靶基因功能注释图。

1.4 GO 富集分析

使用R 语言的clusterProfiler 包和igraph 包分别对实验组、对照组中的差异miRNA 靶基因进行GO富集分析，最后对富集结果进行可视化。

2 结果

2.1 差异miRNA 的筛选

使用R 语言DESeq2 包对原始数据进行分析，发现实验组和对照组样本数据中分别有71 个上调基因和123 个下调基因并绘制MA 图（图1）。其中，横纵坐标分别为两组样本log2（CPM）值。图中每个点代表一个基因，越接近于原点的点表达量越低，红点表示上调基因，绿点表示下调基因，黑色表示非差异基因，上调、下调均是纵轴样本相对于横轴样本。然后，列出实验组和对照组前14 个显著差异表达的miRNA，其中表达上调的miRNA 为5 个（miR-122-5p、 miR-124-3p、 miR-125a-5p、 miR-1273g-5p、hsa-miR-1275）、表达下调的miRNA 为9个（miR-1-3p、miR-101-3p、miR-106b-3p、miR-1185-5p、miR-1185-1-3p、miR-1250-5p、miR-127-5p、miR-1277-3p、miR-1299）（表1）。

表1 实验组与对照组miRNA 表达谱比较Tab 1 Comparison of miRNA expression profiles between the experimental and control groups

图1 差异miRNA 的MA 图Fig 1 The MA plot of the differential miRNA

2.2 差异miRNA受试者工作特征曲线（ROC曲线）

使用R 语言的pROC 包绘制出差异miRNA ROC 曲线。其中横纵坐标分别表示敏感性和特异性。由此算出ROC 曲线下面积（AUC）为0.88，表示本研究数据预测准确性较好。见图2。

2.3 GO 功能富集分析

从实验组和对照组数据得到49 个GO 条目，并通过差异miRNA 靶基因功能富集分析后，得到14个具有显著差异的GO 条目（P＜0.05）。其中有6个条目参与了细胞组成的功能，具体体现在细胞浆、细胞骨架、突触、蛋白的细胞外基质等方面；有2个条目参与了分子功能，具体体现在蛋白连接和鸟嘌呤核苷酸交换因子方面；有6 个条目参与生物过程，具体体现在DNA 转录调控、正向调控GTP 酶、多种细胞器的形成、磷酸化等方面。我们绘制出靶基因GO 注释分类柱状图（图3）和差异miRNA 靶基因功能显著富集功能-基因互作网络图（图4）。

图3 前10 位GO 功能富集分析Fig 3 Functional enrichment analysis of the top 10 GO positions

图4 显著富集功能-基因网络图Fig 4 Significantly enriched function-gene network map

3 讨论

自1954 年人类首次成功实施同质活体肾移植手术以来［5］，目前肾移植技术治疗终末期肾病仍然无法替代［6］。虽然得益于不断进步的肾移植技术和各类新型免疫抑制剂的应用使得肾移植受者的生活质量和存活时间不断提高［7，8］，但是移植肾AR 仍然是影响移植物长期存活的主要危险因素［9］。目前，临床上诊断AR 主要是通过临床表现（包括发热、血压升高、尿量减少、移植肾肿大和疼痛）与实验室检查（血肌酐升高的幅度）进行。同样，彩超也是通过一些非特异性改变（移植肾形态和血流阻力指数）间接诊断AR。因此，在现阶段诊断AR 的金标准仍然是组织活检，但其准确性受病理医师的诊断水平、抽样误差等影响［10］。鉴于以上诊断方法均以发现移植肾的结构和功能损害为依据，所以迫切需要新的、可靠的、非侵入的生物标记物用于在移植肾结构和功能未发生改变之前早期诊断AR，从而最大限度降低AR 对移植肾的损害［11］。

近年来，由于miRNA 具有稳定性、器官组织特异性、参与移植肾排斥反应等特点，逐渐使其成为探索早期诊断AR 的热点［12-14］。miRNA 是一类由19～23 个核苷酸组成的非编码单链RNA 小分子。miRNA 是在转录后水平调控基因表达的，通过与靶mRNA 的3′-UTR 及5′-UTR 区的碱基互补配对抑制翻译、降解mRNA，从而降低翻译效率或阻断mRNA 参与基因调控和表达［15］。一方面，大量研究表明大约有60%的人类转录组受miRNA 调控；另一方面，随着最近高通量测序技术和生物信息学方法的发展，极大的促进了miRNA 的相关研究，包括调控靶点和相关功能预测［16］。Heegaard 等［17］指出miRNA 可以于疾病临床诊断几个月前在外周血中被发现，同时也被证实在肾移植术后不同病种间存在差异性表达，包括AR［18］。

Anglicheau 等［19］通过分析了肾移植术后出现急性排斥的表达谱，发现上调的miR-142-5p、miR-155和miR-223 与CD3 和CD20 mRNA 密切相关，这表明这些miRNA 可能引起免疫细胞在移植物中浸润。通过对移植肾活检，发现miR-10b 在急性排斥的活检组织中下调，并且通过靶向调控BCL2L11 抑制细胞活性和加速细胞凋亡［20］。有研究发现移植肾中高表达的miR-650 与急性排斥相关，进一步研究发现miR-650 是通过靶向调控BCL11B 使caspase-8 高表达，从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡并通过增加INF-γ 的释放，抑制IL-13 的释放，从而增加巨噬细胞的趋化性［21］。有学者使用多变量logistic 回归分析认为从全血细胞中检测出的5 个miRNAs（miR-15b、miR-16、miR103a、miR106a 和miR-107）可以准确区分TCMR（BanffⅡ-Ⅲ）的受者和其他类型损伤的受者［22］。然而，这个团队在后续研究同样的miRNA 在PBMC 中却未能得到相同的结果［23］，这表明某些样本的生物标志物鉴定结果不能简单的扩展至全部总体，因此需要更多的研究来解释不同样本间miRNA 表达差异的相关机制。对于TCMR 受体，miR-99a 和miR-100 的表达上调了［24］。之前的一项研究却发现TCMR 活检组织中miR-99a 的表达降低了［19］。笔者推测，miR-99a 在组织和血清中的表达差异可能是由于外周血中与排斥反应相关的免疫细胞数量少于移植物。有研究发现，在TCMR 期间，尿液中miR-210 的水平显著降低，而miR-210 水平的降低与移植1 年后同种异体移植功能的下降相关，认为miR-210 为TCMR 的有效生物标志物，在随后的研究中也证实了TCMR 患者尿液中miRNA-210 的表达降低，但与miRNA-210 相比，高表达的miRNA-155-5p 对TCMR 具有更好的诊断价值（敏感性为85%，特异性为86%，AUC=0.875；P=0.046）［25］。国内相关研究是运用高通量miRNA 基因芯片检测技术发现了AR 受者血浆中miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p 呈 现 高表达［26］。

相较于以往基因芯片只能检测特定的miRNA，本研究通过使用二代测序的方法除了灵敏度高、通量高等优势外，还可以实现全基因组测序。这将能得到更为完整的miRNA 表达谱。本课题组将所获得的原始数据进行生信分析，发现获得的差异miRNA 主要影响着DNA 转录调控、正向调控GTP 酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子、蛋白的细胞外基质、蛋白连接等相关功能。有研究表明miRNA-1250-5p 是位于宿主基因细胞凋亡关联酪氨酸激酶（AATK）第二个内含子中miRNA，AATK 位于17q25.3［27］。Zhang 等［28］发现在miRNA-1250-5p 宿主基因AATK 的启动子区存在CpG 岛，miRNA-1250-5p 的低表达是通过宿主基因AATK 启动子区的甲基化实现的。近年来较多研究提示DNA 甲基化参与了AR 的发生、发展［29］。同样的，miRNA-1250-5p 在TCMR 的发生、发展中是否有DNA 甲基化参与其中值得进一步研究。

本研究使用二代测序的方法证实了肾移植术后TCMR 患者外周血PBMC miRNA 表达谱存在差异，且共检测出14 个显著差异表达的miRNA，其中5 个miRNA 表达上调（P＜0.05）、9 个miRNA 表达下调（P＜0.05）。这提示这些差异表达的miRNA很可能参与了TCMR 的发生、发展。并进一步预测miRNA-1250-5p 是通过DNA 甲基化调控表达，进而参与TCMR 的发生、发展。本研究通过对AR 更进一步的分类筛选肾移植术后TCMR 的分子标记物为TCMR 的发生发展、诊断和治疗提供了理论依据。

作者贡献度说明：

研究设计为第一作者和通讯作者，第一作者撰写论文，通讯作者审稿，所有作者均参与标本和数据收集，文中作者贡献度等同，不涉及相关利益冲突。