lncRNA NEAT1对口腔鳞癌细胞细胞周期停滞、凋亡及Hippo/YAP信号通路的影响

荣誉 胡志东 赵娜

口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最高发的恶性肿瘤，主要发生于舌部、口底部、牙龈、颊黏膜等部位，具有高复发性和转移性[1]。口腔鳞癌在临床上主要是以手术为主，结合全身化学药物治疗、局部放射治疗、生物治疗等方法进行辅助治疗。NEAT1(nuclear paraspeckle assembly transcript1)基因产生一个长链非编码RNA(lncRNA)，主要富集于细胞核中，是形成和维持细胞核亚结构paraspeckle的关键非编码RNA[2]。LncRNA NEAT1可以通过VEGF-A和Notch信号通路介导口腔鳞癌的进展，具有显著的加速肿瘤细胞生长和促癌作用[3]。LncRNA NEAT1是否可以通过Hippo/YAP信号通路调控口腔鳞癌细胞的发生发展尚不清晰，Hippo信号通路在肿瘤发生、干细胞内稳态调节、组织再生和器官大小控制中起着关键作用。在口腔鳞癌中，激活Hippo信号通路可以抑制肿瘤的恶性生物学行为、上皮间充质转化和远处转移，提高患者的生存率[4]。

本研究将通过转染si-NEAT1探究NEAT1是否可以通过Hippo/YAP信号通路对人口腔鳞癌细胞SCC-9、CAL27和Tca8113增殖、凋亡、细胞周期停滞具有调控作用，并探究其磷酸化修饰在其中发挥的作用，为lncRNA NEAT1基因在肿瘤发生发展中发挥的作用及Hippo/YAP信号通路在口腔鳞癌中的分子修饰调控提供分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人口腔鳞癌细胞SCC-9、CAL27和Tca8113细胞株(中国科学院上海细胞库提供)。

1.2 主要试剂

高糖DMEM、胎牛血清和青链霉素(Gibco，美国)； 兔抗人Mst1/2、Lats1、P-YAP、β-actin 抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(CST公司, 美国)； si-NEAT1和阴性对照 si-NC质粒(上海GenePharma公司)； 转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen公司, 美国)。

1.3 细胞培养及转染

人口腔鳞癌细胞SCC-9、CAL27和Tca8113细胞培养条件: 用含有 10% FBS和1% 双抗(100 U/mL青霉素和 100 μg/mL 链霉素) 的DMEM培养基培养，培养条件：5% CO237 ℃，按照1∶3～1∶4比例传代[5]。划痕实验将调整为1×106接种于6 孔板， 24 h后用枪头垂直于皿底划痕， PBS清洗3 次，加入无血清培养基， 37 ℃ 5% CO2培养箱，培养24 h后拍照。

将细胞调整为2×106的细胞密度接种于培养皿中，当细胞生长至对数期时采用LipofectamineTM2000分别将si-NEAT和 si-NC转染进 SCC-9、CAL27和TCA8113细胞，12 h后换液去除LipofectamineTM2000，36 h后用于各组实验。

1.4 MTT法检测SCC-9、CAL27和Tca8113细胞活力

将1×104个SCC-9、 CAL27和Tca8113细胞接种到6 孔板，待细胞贴壁后将细胞分为对照组、 si-NC组和si-NEAT1转染组，并将细胞培养24、 48、 72 h，严格按照MTT试剂说明进行操作，与酶标仪下测定样品吸光度[7]。

1.5 流式检测细胞凋亡

取对数生长期的细胞按照1×104个/ml细胞密度为分别接种于6 孔板进行培养，贴壁后分组对照组、 si-NC组和si-NEAT1转染组， 48h后收集全部细胞，重悬细胞，加入Annexin V和PI混匀，BD流式细胞仪(BD FACSCantoTMⅡ 流式细胞仪, BD公司，美国)进行细胞凋亡分析，所有操作均在冰上完成并避光孵育[8]。

1.6 Western blot 检测蛋白表达

将对照组、 si-NC组和si-NEAT1转染组SCC-9、CAL27和Tca8113细胞用RIPA蛋白裂解液冰上提取细胞总蛋白，将总蛋白进行SDS-PAGE电泳70 V 15 min、 120 V 2 h， 120V 2.5 h转膜，TBST漂洗3 次，每次5 min， 5%脱脂奶粉封闭1 h， TBST漂洗3 次,每次5 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别按照说明书加入一抗和二抗孵育，TBST漂洗后ECL显色，发光仪(ChemiDoc 凝胶成像系统, Bio-Rad公司，美国)曝光、拍照[9]。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 si-NEAT1对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞活力的影响

与对照组相比，si-NEAT1组在实验终点细胞活力显著受到抑制，并且具有时间依赖性，差异具有显著的统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而si-NC组相对于对照组没有显著的统计学差异(P>0.05)(表 1)。

表 1 si-NEAT1对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞活力的影响

2.2 si-NEAT1对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞迁移能力的影响

与对照组相比，各组细胞转染si-NEAT1后迁移能力下降的趋势，差异具有显著的统计学意义(P<0.05)，而si-NC组相对于对照组没有显著的统计学差异(P>0.05)(图 1)。

2.3 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞凋亡的影响

通过流式分析发现si-NEAT1组转染人口腔鳞癌SCC-9、CAL27和Tca8113细胞后，细胞出现显著凋亡现象，结果具有统计学意义(P<0.001)，而si-NC组与对照组没有显著的差异(P>0.05)(图 2)。

图 1 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞迁移的影响

图 2 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞凋亡的影响

2.4 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞周期的影响

为了进一步探究si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞周期的影响，通过流式细胞实验进行了分析，结果表明si-NEAT1组细胞细胞增殖受到显著抑制， G2/M期细胞比例显著增高，G0/G1期细胞比例显著降低，细胞周期阻滞在G2/M期，结果具有显著的统计学差异(P<0.01)。流式细胞检测显示si-NEAT1转染后人口腔鳞癌SCC-9、CAL27和Tca8113发生显著凋亡WB结果表明si-NEAT1组细胞原癌基因Bcl-2的表达显著降低(P<0.001)。

2.5 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞抑癌通路Hippo/YAP的影响

为了探究si-NEAT1转染抑制人口腔鳞癌SCC-9、CAL27和Tca8113生长的机制，研究了抑癌通路Hippo/Yap信号通路中关键分子Mst1/2、Lats1和p-Lats1， P-Yap的蛋白表达水平。Western blot结果显示(图3)相对于内参β-actin，Mst1/2、Lats1蛋白表达量上调(P<0.05)， p-Lats1、P-Yap 蛋白水平增高(P<0.05)，相对定量结果进一步证实出这种趋势。

表 2 si-NEAT1转染对SCC-9、CAL27和Tca8113细胞周期的影响(%)

3 讨 论

口腔鳞癌通常发生在口腔， 包括舌、牙龈、颊、腭、口底等部位，由于口腔黏膜被覆的是鳞状上皮，这些部位发生的癌变就称为鳞状上皮癌。口腔的鳞状上皮癌除了局部增生，侵蚀周围组织造成功能障碍以外，还经常会发生相应的颈部的淋巴引流区的淋巴转移[10]，是口腔癌里边高发的恶性肿瘤。

NEAT1主要富集于细胞核中，是形成与维持细胞核亚结构paraspeckle的关键非编码RNA。NEAT1具有促进肿瘤生长的作用，研究表明在前列腺癌种，NEAT1可被招募并富集CDC5L蛋白至细胞核中的paraspeckle，促进CDC5L对靶基因AGRN的转录激活作用，AGRN起到了促进DNA损伤修复的作用。对NEAT1表达水平的敲低抑制了CDC5L-AGRN转录调控通路的活性，导致前列腺癌细胞DNA损伤的累积，从而影响了细胞周期与增殖[11]。既有研究表明细胞的增殖,线粒体依赖性凋亡以及G2/M期周期阻滞在口腔鳞癌中发挥重要作用[12]，同时在胃癌的研究表明NEAT1在胃癌细胞中高表达，可以作为癌基因调控胃癌细胞的凋亡、侵袭、增殖和化疗耐药，可能成为胃癌新的潜在治疗靶点之一[13]。

本研究发现si-NEAT1可使人口腔鳞癌SCC-9、CAL27和Tca8113细胞活力显著受到抑制，与时间呈负相关关系，同时可以显著诱导细胞凋亡，同时可以显著诱导细胞凋亡，从增殖和凋亡双向抑制中细胞生长，进一步本研究发现，si-NEAT1组细胞细胞增殖受到显著抑制，G2/M期细胞比例显著增高，G0/G1期细胞比例显著降低，细胞周期阻滞在G2/M期。

Hippo信号传导通路是癌症发生和转移、组织再生以及干细胞的功能调控上发挥着重要的信号通路。Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应因子YAP。YAP蛋白能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、控制器官生长发育，其功能的发挥与蛋白磷酸化相关[14]。本研究表明，si-NEAT1组细胞Mst1/2、Lats1蛋白表达量上调，p-Lats1、P-YAP蛋白水平增高，这提示si-NEAT1转染后可以激活Hippo-YAP信号通路上游关键分子Mst1/2、Lats1，促使YAP蛋白磷酸化，进而实现肿瘤细胞活性抑制的作用。

综上, 本研究通过证实转染si-NEAT1可以抑制口腔鳞癌细胞细胞增殖，细胞凋亡，调控细胞周期引发周期停滞，抑癌通路Hippo/YAP信号通路及YAP蛋白的磷酸化在此过程中发挥重要作用。