老年自发性蛛网膜下腔出血患者MTHFR C677T基因多态性与颅内动脉瘤相关性分析

吉洁，江晔，罗聪，吴少帅，毕永延，徐福林，李小六

1.复旦大学附属闵行医院（上海市闵行区中心医院）康复医学科，上海 201199；2.复旦大学附属闵行医院（上海市闵行区中心医院）神经外科，上海 201199

颅内动脉瘤（IAs）是1 种危及生命的疾病，需要紧急医疗救治。蛛网膜下腔出血（SAH）是IAs 破裂最常见的临床表现［1］。高龄是动脉瘤生长和破裂的重要危险因素，而有研究报道年龄与动脉瘤破裂呈明显相关性［2-3］。老年患者动脉瘤破裂后更容易出现不良预后，给社会和家庭带来了沉重的负担［4］。流行病学研究表明，SAH 的发病率随着年龄的增长而不断增加，老年患者SAH 的发病率是普通人群的3～4 倍［1］，这就突显了自发性蛛网膜下腔出血老年患者动脉瘤破裂风险评估的重要性［5］。然而，数字减影脑血管造影（DSA）等影像学检查手段因其特殊性往往在临床应用中有一定的局限性。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T 是677 位点的点突变（胸腺嘧啶核苷酸取代半胱氨酸），这个点突变使MTHFR 失去甲基化同型半胱氨酸（Hcy）的作用，影响了Hcy 正常代谢过程，因而在体内积聚，导致高同型半胱氨酸血症（HHcy）［6］。临床上血液标本易于采集，指标检测简单易行，HHcy 是IAs 发生发展的危险因素，而且MTHFR 基因是Hcy 代谢进程中再甲基化途径的关键酶［7-8］，本研究拟探讨老年自发性蛛网膜下腔出血患者血清MTHFR C677T 的多态性与IAs 的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

经复旦大学附属闵行医院医学伦理委员会批准，收集2018年1月—2021年12月期间在复旦大学附属闵行医院（上海市闵行区中心医院）确诊为自发性SAH 蛛网膜下腔出血的老年住院患者90 例作为观察组（老年颅内动脉瘤破裂组62 例、老年非动脉瘤SAH组28 例），另选取90 例门急诊头颅CT 排除SAH 的人群作为对照组。所有患者年龄60～96 岁、平均（72.3 ±10.6）岁，其中男性103 例，女性77 例；老年颅内动脉瘤破裂组年龄60～91 岁、平均（76.1 ±12.9）岁，其中男性37 例，女性25 例；老年非动脉瘤SAH 组年龄62～94岁、平均（73.4 ±10.8）岁，其中男性18 例，女性10 例；对照组患者年龄64～96 岁、平均（70.6±8.5）岁，其中男性48 例，女性42 例。

入选标准：（1）观察组：≥60 岁自发性蛛网膜下腔出血患者（男女不限），根据DSA 检查明确有/无IAs 分为老年颅内动脉瘤破裂组、老年非动脉瘤SAH组；（2）对照组：随机入选同期门急诊头颅CT 排除SAH 的人群 体检正常人群，年龄、性别等基础资料与观察组相匹配。排除标准：（1）有外伤史；（2）有恶性肿瘤、动脉瘤病史；（3）2 周内服用B 族维生素或抗癫痫药物等；（4）有严重的精神疾患、意识障碍或其他原因不能/不愿配合治疗者。

1.2 实验方法

1.2.1 血浆Hcy 检测入组的研究对象分别采集空腹外周静脉血5 mL，置于EDTA 抗凝试管，充分摇匀后保存于40 ℃温箱。标本经3 000 r/min 离心分离血浆。采用循环酶法来测定Hcy 含量，根据分组记录数据，并根据检测数值分层为血清高Hcy 水平（＞15 μmol/L）和血清低Hcy 水平（＜15 μmol/L）。Hcy 参考范围正常为5～5 μmol/L。

1.2.2 MTHFR 基因分型入组的研究对象分别采集空腹外周静脉血2 mL，EDTA 抗凝处理，后经实时荧光定量PCR 法检测所得标本。依据人MTHFR基因多态性检测试剂盒操作说明提取血液基因组，LightCycler480（罗氏）荧光定量PCR 平台使用PCR-荧光探针法体外检测人外周血基因组DNA 中MTHFR基因C677T 多态性位点。

1.3 统计学分析

统计分析采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，行t检验；计数资料以例和百分率表示，行χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组人群MTHFR C677T 基因型分布情况比较

分别计算3 组研究对象中纯合突变型（TT 型）、杂合突变型（CT 型）、野生型（CC 型）在组内所占百分比，采用χ2检验统计分析：自发性蛛网膜下腔出血老年患者MTHFR C677T TT 型分布频率较对照组高，CC 型较对照组低，且3 组间差异有统计学意义（P＜0.05）；CT 型分布频率在3 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 MTHFR C677T 基因型频率分布比较［例（%）］

2.2 颅内动脉瘤与MTHFR C677T 的TT 型的关系

分别计算各组MTHFR C677T 的TT 型在组内所占百分比；采用χ2检验统计分析：（1）老年颅内动脉瘤破裂组患者MTHFR C677T 的纯合突变型（TT型）分布频率高于老年非动脉瘤SAH 组、老年正常对照组患者。见表2。

表2 MTHFR C677T 的TT 型与颅内动脉瘤关系比较

2.3 不同血清Hcy 水平下MTHFR C677T TT 基因型分析

首先根据血清Hcy 水平分别将3 组人群进行分层；然后分别计算3 组研究对象中TT 型、CT 型、CC型在各层中所占百分比。采用χ2检验统计分析比较各层人群中MTHFR C677T 各型频率分布情况。MTHFR C677T 的TT 型分布频率显示：血清高Hcy 组高于低Hcy 组，且结果差异有统计学意义（P＜0.05）。杂合突变型CT 型、野生型CC 型在各层中频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 MTHFR C677T 的TT 型频率分布与Hcy 水平关系［例（%）］

3 讨论

IAs 是位于脑主干分支动脉的病理扩张，有害的血流动力学因素，如血流动力学应激和血管危险因素（包括高血压、脂质积累、动脉硬化和吸烟），以及遗传倾向，都参与了动脉瘤形成的过程［9］。IAs 破裂会导致SAH，而大多数关于IAs 形成的研究数据来自于不同部位动脉瘤破裂的SAH 患者，这个亚群比一般人群更容易被确诊为IAs［9］。老年IAs 破裂的处理仍然是脑血管疾病治疗中的一个主要挑战［1］。

遗传因素在IAs 的发病机制中起重要作用，编码血管壁成分或参与血管生成和血管重构的基因多态性被认为与脑动脉瘤的形成有关［10］。Hcy 是由蛋氨酸代谢而来的一种含硫的非蛋白原性氨基酸，其血浆水平为5～10 μM，高于15 μM 为HHcy［8］。由于其容易造成人体血管内血栓形成并积聚、参与血管内皮损伤造成微血管结构病理变化，已成为心脑血管疾病发病的重要诱发因素［8］。据报道，影响Hcy 代谢的基因多态性不仅可促进动脉粥样硬化、缺血性中风、颈动脉夹层和腹主动脉瘤的发生［11-13］，也与IAs 的发生相关［7］。动物研究证明，富含蛋氨酸的饮食诱导的HHcy 加速了大鼠脑动脉瘤的形成，这可能是通过对血管壁建模关键分子表达的差异效应［14］。在1 项针对中国汉族人群的队列研究中，HHcy 被证实是IAs 的独立危险因素［15］。

MTHFR C677T 多态性T 等位基因纯合的个体具有HHcy 表型［8］。它定位于1 号染色体短臂末端（1p36.6），且对叶酸代谢有重要意义。正常代谢中，在维生素B12 和叶酸存在的情况下，MTHFR 通过参与Hcy 代谢从而将Hcy 水平维持在正常范围［16］。有研究显示MTHFR C677T 基因第4 外显子突变时，导致密码子222 处缬氨酸转化为丙氨酸，从而降低了该酶的活性，使得Hcy 再甲基化通路受阻，易形成HHcy［17］。纯合子突变的受试者Hcy 水平较高，而杂合子突变的受试者Hcy 水平较正常、未突变的对照组略有升高［18-20］。鉴于这种多态性对患者发病率和死亡率的影响，其重要性日益增强，作为未来健康教育的一部分，有必要采取进一步的预防策略和营养建议，以控制血浆Hcy 水平升高造成的心脑血管病理损害［6］。

Hcy 代谢进程中，MTHFR C677T 发挥着重要的代谢酶的作用，二者关系密切。MTHFR C677T 多态性与多种疾病有关，比如颅内动脉瘤、颅内动脉粥样硬化性狭窄、颈动脉狭窄、颈动脉夹层、冠心病、主动脉夹层和主动脉瘤等都有一定的相关性。MTHFR C677T 多态性检测适用范围广泛，并且有越来越多的相关文献发表。本研究的目的是检验影响Hcy 代谢的MTHFR C677T 基因多态性和IAs 之间的相关性，这可能有助于老年患者动脉瘤破裂的评估。老年患者往往具有多种基础性疾病，本研究制定排除标准将恶性肿瘤、动脉瘤病史排除在外，并且将老年人常见的高血压、心脏病、糖尿病、高血脂、年龄、性别等基础资料与观察组相匹配。在本次研究收集了年龄≥60岁的老年自发性蛛网膜下腔出血患者血液标本，经实验室检测、统计分析发现，老年颅内动脉瘤破裂组MTHFR C677T 的TT 型分布频率高于老年非动脉瘤SAH组、老年正常对照组；而CC 型分布频率低于老年非动脉瘤SAH 组、老年正常对照组；CT 型分布频率则与老年非动脉瘤SAH 组、老年正常对照组差异无统计学意义。然而，MTHFR CT 基因型与IAs 是否也有相关性，文献报道不一，本研究析这种差异的原因可能有两点：一是受试人群存在地区差异，二是需进一步提高数据样本量。为了进一步验证本研究结论的准确性，本研究分析了MTHFR C677T 基因多态性频率分布与血清Hcy 的关系，结果发现血清高Hcy 组TT 型频率分布高于低Hcy 组，提示MTHFR C677T TT 型与血清Hcy 的表达水平相关，而血清Hcy 代谢密切影响人体心脑血管性疾病。所以，本研究为MTHFR C677T 的TT 型预测IAs 的敏感度与血清高Hcy 水平具有一致性。当然，本研究选择的老年自发性蛛网膜下腔出血人群本身可能存在着选择偏倚，研究样本量也存在一定局限，并且本研究对象为破裂的动脉瘤，并没有涉及未破裂动脉瘤，所以也存在一定需要进步研究的问题，在MTHFR C677T 的TT 型与IAs 相关性的后期研究中会进一步改善。

综上述，本研究发现患者血清MTHFR C677T 的TT 型与颅内动脉瘤有相关性，其可能是IAs 的独立危险因素，对于颅内动脉瘤易感人群有非常好的健康教育意义。