淫羊藿苷通过YAP促进大鼠关节软骨细胞增殖的研究

鲍远 聂铭博 李孟伟 蒋永桥 康皓

创伤或衰老引起的组织损伤需要通过组织细胞再生来恢复结构和功能。组织再生的机制包括两种：一种是局部存在具有定向分化能力的干细胞，如皮肤；另一种是组织内的终末分化细胞被重新激活，如肝脏[1]。然而很多人体组织不具备完全再生能力，这些组织损伤后，主要通过纤维化或瘢痕修复，从而造成组织、器官不同程度的功能障碍[1]。关节软骨就是属于这种不能再生的组织。以往治疗关节软骨损伤的方法包括骨髓刺激技术和自体软骨移植，虽然在临床上应用已久，但并不能保证软骨的有效修复，长期临床效果并不理想[2-5]。因此，揭示组织再生修复的具体机制，对于研究非再生组织的损伤修复具有重要意义。

Hippo 通路是一个高度保守的信号转导通路，它被认为是调节器官生长的主要机制。在哺乳动物中，其关键成员包括：MST1/MST2、LATS1/LATS2、SAV1 和MOB1A/MOB1B[6]。该通路的核心是激酶的级联反应，MST1/MST2和LATS1/LATS2 相继激活后，使下游的yes 相关蛋白（yes-associated protein，YAP）和PDZ结合基序转录共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）发生磷酸化而失活，从而抑制YAP/TAZ的协同转录活性[7]。血管再生时，新生血管内皮细胞中的YAP 表达量丰富，这意味着血管再生与YAP被激活有关[8-9]。在小鼠体内过度激活YAP/TAZ 会导致多个器官的过度生长，如肝脏、心脏等[10-11]。因此，Hippo通路及其效应蛋白YAP/TAZ的发现为组织损伤的再生修复提供了一种可能的干预机制。

淫羊藿苷（icariin）是一种异戊烯基黄酮醇苷类化合物，是我国传统中药淫羊藿的主要药理学活性成分[12]。研究证实，淫羊藿苷通过诱导MC3T3-E1 细胞进入分裂期并下调周期抑制蛋白CDKN2B 的表达来促进其分裂增殖[13]。细胞增殖是组织再生的基础，而YAP是参与组织器官生长的关键因子，因此，YAP有可能参与组织损伤后的细胞增殖过程。综上，笔者推测淫羊藿苷可能通过调控YAP来促进细胞增殖。本研究探讨淫羊藿苷是否能促进体外培养的大鼠关节软骨细胞的增殖，以及YAP在淫羊藿苷促进细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验动物、试剂与仪器

关节软骨细胞取自7 日龄Sprague-Dawley 大鼠的膝关节。大鼠来源于华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0009，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2021-0057。所有动物实验操作均经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准。

主要试剂与仪器：胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、青霉素和链霉素（美国Gibco 公司），Ⅱ型胶原酶、DAPI 和Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司），总RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒和SYBR green（瑞典Azanno Biotech 公司），BCA 蛋白浓度检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的二抗溶液和超敏ECL化学发光检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），DMEM/F12（美国HyClone 公司），CCK8 试剂盒（日本Dojindo 公司），PVDF 膜（美国Millipore 公司），FITC 偶联的鬼笔环肽（美国Sigma-Aldrich 公司），PCNA、YAP、phospho-YAP、Ki67和CTGF抗体（美国CST公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），免疫荧光显微镜（日本Nicon公司），酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 细胞分离和培养

采用颈椎脱臼法处死大鼠，然后用乙醇浸泡尸体消毒15 min。解剖大鼠四肢，切取关节软骨放入培养皿中，用剪刀将软骨剪成大小约0.5 mm3的小碎块，加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化15 min。去除胰蛋白酶溶液，加入0.1%的Ⅱ型胶原酶后，在37℃培养箱内孵育8 h。然后在离心机内以1200 r/min的速度离心5 min，去除上清液，收集软骨细胞沉淀。软骨细胞用含有10%胎牛血清、青霉素（100 IU/mL）和链霉素（0.1 mg/mL）的DMEM/F12吹打分散，并放入含5%CO2的37℃保温箱中培养。

1.3 细胞增殖实验

用CCK8 试剂盒来测定软骨细胞增殖情况。以每孔3000个细胞的密度将软骨细胞接种至96孔板中。24 h后，用不同浓度的淫羊藿苷（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol/L）分别干预1、2、3、4和5 d，每个浓度设置3 个复孔。每天更换新鲜的培养基和药物。检测时，去除孔内旧的培养基，加入90 μL新鲜培养基和10 μL CCK8溶液，并在37℃下避光孵育1 h。最后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

1.4 Western Blot实验

用1 μmol/L 的淫羊藿苷分别干预软骨细胞0、4、8、12 和24 h。然后用Western Blot 检测YAP 的表达量和磷酸化程度。干预方法为：0 h 组用常规培养基培养24 h；4 h组用常规培养基培养20 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷继续培养4 h；8 h组用常规培养基培养16 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷继续培养8 h；12 h 组用常规培养基培养12 h后，加入1 μmol/L 的淫羊藿苷继续培养12 h；24 h 组加入1 μmol/L 的淫羊藿苷培养24 h。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 溶液裂解软骨细胞。在低温（4℃）高速（12000g）离心机内离心20 min 后提取上清液。用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样本中不同分子量的蛋白质，并将其转移至PVDF膜上。转膜后，把PVDF 膜放在5%的BSA 溶液中常温封闭1 h，然后在4℃条件下将PVDF 膜放入含一抗的溶液中孵育过夜。次日将PVDF膜放入TBST溶液中漂洗3次，并在辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中常温孵育1 h。最后采用超敏ECL化学发光检测试剂盒与凝胶成像系统检测和分析目的蛋白印迹。

1.5 RT-qPCR实验

用0.01、0.1、1 和10 μmol/L 的淫羊藿苷干预软骨细胞，2 d 后检测Ki67、PCNA、CyclinD1、YAP、Ankrd1和CTGF基因的表达情况。用1 μmol/L 的淫羊藿苷干预软骨细胞，分别干预0、12、24、36 和48 h，然后检测Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表达情况。干预方法为：0 h组用常规培养基培养48 h；12 h 组用常规培养基培养36 h 后，加入1 μmol/L 的淫羊藿苷继续培养12 h；24 h 组用常规培养基培养24 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷继续培养24 h；36 h组用常规培养基培养12 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷继续培养36 h；48 h组加入1 μmol/L的淫羊藿苷培养48 h。软骨细胞在Trizol试剂中裂解后，用总RNA提取试剂盒提取细胞裂解中的总RNA。采用cDNA合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA。实时定量PCR 在含有2×SYBR green、引物、cDNA 和双蒸馏水的20 μL 反应体积中进行。引物序列如下：PCNA forward 5’-AAGGGCTGAAGATAATGCTGATA-3’，PCNA reverse 5’-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3’；Ki67 forward 5’-CGGAGCACTTTGAAACACCA-3’，Ki67 reverse 5’-TGTCACGGCAGAGAGTTCTT-3’；CyclinD1 forward 5’-TGCGTGCAGAGGGAGATTGT-3’，CyclinD1 reverse 5’-GCGGATAGAGTTGTCAGTGTAGATG-3’；YAP forward 5’-ACCCTCGTTTTGCCATGAAC-3’，YAP reverse 5’-CCTGCCGAAATAACTCCTGC-3’；Ankrd1 forward 5’-TGGCAGAATGGAACCAAAGC-3’，Ankrd1 reverse 5’-TCTCCCTATTTGGCTGGCAA-3’；CTGF forwards 5’-ACCAGTGTGAAGACCTACCG-3’，CTGF reverse 5’-GTCCCTTACTCCCTGGCTTT-3’；GAPDH forward 5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’，GAPDH reverse 5’-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3’。

1.6 免疫荧光染色

用1 μmol/L的淫羊藿苷干预软骨细胞后，通过免疫荧光染色检测Ki67 在细胞内的表达情况及YAP 的亚细胞定位。在室温下软骨细胞用4%的多聚甲醛固定15 min，然后用0.3%的Triton X-100处理10 min，以及用5%BSA封闭1 h。然后在4℃下用一抗溶液孵育过夜。弃去一抗溶液，用PBS 清洗3 遍，再加入荧光标记的二抗溶液，在避光和常温条件下孵育1 h。肌动蛋白用FITC 偶联的鬼笔环肽孵育30 min，细胞核用DAPI 孵育5 min。最后用免疫荧光显微镜检测目标蛋白的显色情况。

1.7 细胞转染实验

使用含有针对大鼠YAP mRNA的shRNA的慢病毒载体（pLKO.1）进行YAP 沉默实验。设计的3 条shRNA 序列如下：GGTCAGAGATACTTCTTAAAT，GGGCCTCTTCCTGATGGATGG，GGCAATACGGAATATCAATCC。阴性对照序列为：GCAAGCTGACCCTGAAGTT。通过将包装质粒psPAX2、 pMD2. G 和shRNA pLKO. 1 载 体 共 转 染HEK293-T 细胞产生慢病毒颗粒，并收集病毒上清液。软骨细胞在稀释的病毒上清液（1∶1）中培养8 h。弃去上清液，用普通培养基培养24 h 后，再用含有2 μg/mL 嘌呤霉素的培养基培养细胞5 d，幸存的细胞即为转染成功的细胞。通过实时定量PCR 和Western Blot 确定具有最佳沉默效果的shRNA。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学数据分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对关节软骨细胞增殖的影响

如图1A 所示，0.01、0.1、1 和10 μmol/L 的淫羊藿苷具有明显的促进软骨细胞增殖的作用（P＜0.05）。其中，在1 μmol/L的淫羊藿苷作用下，细胞数量最多，意味着细胞增殖最活跃。在0.01 ～10 μmol/L 的范围内，随着淫羊藿苷浓度的增加，PCNA、Ki67和CyclinD1基因的表达先增加，在0.1 或1 μmol/L 时达到顶峰，随后开始下降（见图1B）。随着干预时间的延长，PCNA和Ki67基因的表达逐渐增加，CyclinD1基因的表达总体呈上升趋势（见图1C）。免疫荧光染色结果显示，淫羊藿苷干预后，软骨细胞内Ki67的表达明显增多（见图1D）。

图1 淫羊藿苷对关节软骨细胞增殖及其相关基因表达的影响：A.淫羊藿苷对细胞增殖的作用；B.在不同浓度的淫羊藿苷作用下，Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表达情况；C.在淫羊藿苷干预的不同时间点，Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表达情况；D.淫羊藿苷对Ki67蛋白表达的影响

2.2 淫羊藿苷促进YAP及其靶基因的表达

随着淫羊藿苷浓度的增加，YAP及其靶基因的表达逐渐增加，当浓度达到10 μmol/L 时，这些基因的表达下降（见图2A）。随着淫羊藿苷干预时间的延长，YAP及其靶基因的表达总体呈上升趋势（见图2B）。

图2 淫羊藿苷对YAP及其靶基因表达的影响。A.在不同浓度的淫羊藿苷作用下，YAP及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表达情况；B.在淫羊藿苷干预的不同时间点，YAP及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表达情况。

2.3 沉默YAP基因后能抑制淫羊藿苷上调增殖相关基因表达的作用

预先设计3 种不同序列的shRNA（shYAP1、shYAP2和shYAP3），采用qPCR 和Western Blot 的方法筛选出最佳序列shYAP3（见图3A），将其应用于后续实验。随着YAP基因的沉默，靶基因（CTGF和Ankrd1）以及增殖相关基因（PCNA、Ki67和CyclinD1）的表达被显著抑制，而且淫羊藿苷不再促进这些基因的表达（见图3B、图3C）。Western Blot 结果显示由于YAP的沉默，CTGF 和PCNA 蛋白的表达被抑制，同时，淫羊藿苷不再促进CTGF 和PCNA蛋白的表达。

图3 沉默YAP基因后，淫羊藿苷对YAP靶基因及增殖相关基因表达的影响：A.三条shRNA序列对YAP基因的沉默效果；B.沉默YAP基因后，YAP 及其靶基因（CTGF 和Ankrd1）的表达，以及淫羊藿苷对这些基因表达的作用；C.沉默YAP 基因后，增殖相关基因（PCNA，Ki67和CyclinD1）的表达，以及淫羊藿苷对这些基因表达的作用；D.沉默YAP基因后，PCNA和CTGF蛋白的表达，以及淫羊藿苷对这些蛋白表达的作用

2.4 淫羊藿苷能促进YAP去磷酸化并进入细胞核内

Western Blot结果显示，随着干预时间延长，YAP的磷酸化程度降低（见图4A）。免疫荧光结果显示，在淫羊藿苷的作用下，YAP 主要集中在细胞核内，而对照组中，YAP均匀分布在细胞内（见图4B）。

图4 淫羊藿苷对YAP磷酸化程度及亚细胞定位的影响：A.在淫羊藿苷干预的不同时间点，YAP蛋白的磷酸化程度和总YAP蛋白的表达量；B.淫羊藿苷作用后，YAP蛋白的亚细胞定位

3 讨论

关节软骨损伤后难以完全再生，这可能与成熟软骨中缺乏血管、软骨细胞密度较低及增殖能力差等因素有关[14-15]。随着组织工程技术的发展，基质联合自体软骨细胞植入在治疗关节软骨缺损中具有显著的潜力。然而组织工程支架的生物力学特性、细胞亲和性等方面存在的问题，以及支架中软骨细胞容易发生退变是限制软骨组织工程发展的关键瓶颈[2]。如何提高软骨细胞自身的增殖能力，启动损伤部位软骨的再生过程，对于软骨损伤的修复具有重要意义。

在本研究中，采用不同浓度的淫羊藿苷（0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol/L）去干预软骨细胞，通过CCK8 试剂盒检测发现0.0001 和0.001 μmol/L 的淫羊藿苷对软骨细胞不具有明显促进细胞增殖的作用（P＞0.05）。而在0.01 ～1 μmol/L 的浓度范围内，淫羊藿苷具有显著促进细胞增殖的作用（P＜0.05），且随着浓度的升高，细胞的增殖速度逐渐增加。当淫羊藿苷浓度达到10 μmol/L时，细胞增殖速度虽然比对照组高，但比1 μmol/L组低，原因可能是高浓度的淫羊藿苷对细胞产生了一定的毒性。淫羊藿苷促进关节软骨细胞增殖的有效浓度范围与其他文献中报道的促进骨髓间充质干细胞增殖的有效浓度范围一致[16]。PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白；Ki67在处于有丝分裂期的细胞中活跃表达；CyclinD1属于细胞周期蛋白家族，能促进有丝分裂的进行，因此它们能作为评价细胞增殖的分子标志[17-18]。在0.01 ～1 μmol/L的淫羊藿苷作用下，软骨细胞内PCNA、Ki67 和CylinD1 的表达均明显升高，进一步证实淫羊藿苷促进软骨细胞增殖的作用。然而仅仅触发终末分化细胞的增殖并不足以完成有效的再生过程[19]，组织的再生过程存在其他调控机制。

Hippo 信号通路及其效应蛋白YAP/TAZ 被认为是胚胎组织器官生长发育的主要调节器。同时，它还参与器官和组织的再生修复，调节细胞的增殖、去分化，以及干细胞或祖细胞的扩增等过程[6-7]。出生后哺乳动物的心肌细胞一直被认为不具有再生能力。然而通过抑制Hippo 信号通路来提高YAP的活性，会导致小鼠的心肌细胞重新获得增殖和再生的能力[11,20]。在心肌梗死的小鼠模型中，通过抑制Sav1或LAT1/LAT2基因来激活YAP/TAZ，能启动心肌的再生修复，改善心脏功能，增加小鼠存活率[19,21]。这些研究结果提示，重新激活与胚胎细胞增殖和器官生长有关的YAP/TAZ可能会触发非再生组织器官的细胞增殖和再生过程。本研究发现，沉默YAP基因的表达不但能够抑制软骨细胞增殖，而且能消除淫羊藿苷促进增殖的作用，进一步证明YAP在软骨细胞增殖过程中的关键作用。此外，淫羊藿苷不仅能促进YAP 及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表达，还能使YAP去磷酸化而活化。活化的YAP进入细胞核内，能启动增殖和再生过程。在淫羊藿苷的作用下，软骨细胞中的YAP表达显著升高并进入细胞核内，该结果证实淫羊藿苷具有激活YAP活性的作用。由于活化的YAP能够触发非再生组织的细胞增殖和再生过程，笔者推测淫羊藿苷有可能通过激活YAP 来启动成熟关节软骨的再生过程，从而促进损伤软骨的再生修复。