离子温度双敏感型黏膜创面保护胶性能及黏膜修复有效性体外评价研究

2022-08-18 00:56杨敏一王涵曾行孟珠王春仁
北京生物医学工程 2022年4期
关键词:创面凝胶黏膜

杨敏一 王涵 曾行,2 孟珠 王春仁

0 引言

中国每年新增食道癌、胃癌、结肠癌病例约25万、41万和37万,在肿瘤病病例中位居第4位、第2位和第3位[1]。内镜黏膜下切除术(endoscopic submucosal dissection,ESD)已成为早期肿瘤或癌前病变主要的治疗手段,因其微创、可一次性切除病变组织等优点,在消化道黏膜病变治疗中应用越来越多[2]。但是,该方法能够造成较大的溃疡创面,又因结直肠壁肌组织较薄,黏膜下层有丰富的血供等因素,ESD术后出血、穿孔等病发率也随之增高,其中胃部延迟性出血率约4.6%~15.6%[3-4],穿孔率6.1%~9.6%[5],并发症较高的发生率阻碍了ESD的广泛应用。人工溃疡愈合慢,消化道内一些物质对创伤面的二次伤害是术后并发症的主要原因。因此构建一种能够粘附于创伤表面,阻挡有害物质,并能促进溃疡愈合的材料,能够有效减少ESD术后并发症的发生,促进ESD术后的推广使用。聚乙二醇[6]、纤维蛋白胶[7]、聚乙酸补片[8]等可以止血和保护受伤组织,但是很少有生物材料在防护的同时还具有促进损伤修复的作用。

理想的生物材料应无毒、细胞相容性良好,在低温下具有很好的流动性。羟丙甲基纤维素和海藻酸钠是《中华人民共和国药典》所列的药用辅料。海藻酸钠是一种天然材料,是从天然藻类中提取的由β-D甘露糖醛酸(M)和α-L古洛糖醛酸(G)组成的多糖化合物[9],在体内具有较好的生物相容性[10]和组织黏附性,羟丙甲基纤维素是一种多糖衍生物,具有可逆热凝胶性质,也可用于内镜黏膜下注射[11-12]。本研究引入一种离子温度双敏感的凝胶(产品来自杭州英健生物科技有限公司,专利号:202010292915.X,论文中涉及产品内容部分已获专利负责人同意),由胶体液和固定液双组分组成,胶体液主要是由海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆等材料组成,固定液主要由氯化钙组成。该凝胶在低温下为液体状态,在生理温度下转化为凝胶状。通过对其理化性能和生物学有效性进行研究从而判断其在ESD术后修复的作用。本研究的主要目标是开发一种生物材料,在内镜黏膜剥离中既能解除损伤又能促进伤口修复。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

扫描电子显微镜(Hitachi S-4800);流变仪(MCR92,安东帕生产);细胞培养瓶(康宁);酶标仪(Thermo Fisher);冷冻干燥机(北京立德泰科技有限公司);恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);倒置荧光显微镜(OLYMPUS);CO2培养箱(Thermo Fisher);细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司);高速冷冻离心机(kokusan H-80R)。

高糖培养基(Dulbecco’s modified eagle medium/F12,DMEM,上海源培生物科技股份有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,Gibco);抗生素(Gibco);Cell Counting Kit-8(CCK-8,日本同仁);胰酶(Gibco);CCD 841 CoN 细胞(广州吉尼欧生物科技有限公司)。

1.2 样品制备

取0.5 mL胶体液于培养皿中,加入1 mL固定液,静置30 min,弃去固定液。

1.3 凝胶物化性能

1.3.1 结构表征

微观结构:将干燥至恒重的凝胶样品表面喷金箔,用扫描电子显微镜观察干燥样品微观结构[13]。

宏观结构:取2 mL胶体液于10 mL透明西林瓶中,分别在4 ℃、室温(25 ℃)及37 ℃静置15 min,观察胶体液在不同温度下的状态。

1.3.2 凝胶成胶时间

采用“倒瓶法”观察样品在37℃成胶时间[14]。将含有胶体液的透明西林瓶放入37℃恒温水浴锅中,每隔30 s取出,瓶口倾斜45°,观察样品流动性。若胶体液15 s内不流动,将瓶口倒置,样品不流动则说明样品已达凝胶化,实验重复3次。

1.3.3 初始成胶温度

流变仪对凝胶的初始成胶温度进行测定[15]。采用温度扫描模式,固定频率1 Hz,应变力1%,升温速率2 ℃/min,扫描温度范围:0 ℃~70 ℃。

1.3.4 凝胶溶胀率(swelling rate,SR)

该凝胶属于生物部分解离材料,在室温下很难达到平衡溶胀比,因此采用经典的重量法测定凝胶在解离前的最大溶胀比[16]。将干燥至恒重的凝胶称重并放入24孔板中,加入2 mL生理盐水,每隔一段时间取出部分凝胶用滤纸吸去表面游离水并称重,计算凝胶溶胀率。

式中:W为溶胀后凝胶质量;W0为初始质量。

1.4 黏膜修复有效性

1.4.1 凝胶浸提液对CCD 841 CoN细胞增殖的影响

浸提时间对CCD 841 CoN细胞增殖的影响:用CCK-8法测不同浸提时间浸提液对细胞增殖的影响[17]。将浸提24 h、48 h、72 h的凝胶浸提液用DMEM培养基稀释为50%浓度,无血清培养基作为对照,样品组为浸提不同时间稀释后的浸提液。培养24 h、48 h、72 h后加入CCK-8溶液,2.5 h后在450 nm处测吸光度,计算细胞相对增殖率,探究最佳浸提时间。

浓度对CCD 841 CoN细胞增殖的影响:样品浸提24 h,以DMEM基础培养基作为对照组,实验组分别为100%组、50%组、25%组、12.5%组、6.25%组,培养不同时间后加入CCK-8溶液,2.5 h后在450 nm处测吸光度,计算细胞相对增殖率,探究其促进细胞增殖的最佳浓度。

1.4.2 浸提液对细胞迁移能力的影响

采用细胞划痕的方法观察样品浸提液对CCD 841 CoN细胞迁移的影响[18]。细胞以2×105/mL接种于24孔板中,细胞融合80%左右后用200 μL枪头划痕,加入分组培养液培养。含10%FBS培养基作为阳性对照,DMEM基础培养基作为阴性对照,样品组为稀释不同浓度的浸提液,在0 h、12 h、24 h、36 h用倒置荧光显微镜拍照,Image J计算划痕面积并计算细胞迁移率,从而确定不同浓度浸提液对细胞迁移能力的影响。

式中:St为th视野中划痕面积;S0为0 h视野中划痕面积。

2 结果与分析

2.1 结构表征

扫描电镜观察其微观结构发现(图1)凝胶表面粗糙,呈波纹状,分布均匀且保持致密无孔洞结构。波纹状可能是样品冷冻干燥后亲水区留下的痕迹。波纹形状分明但保持均匀表明凝胶中的成分是有序聚集而非溶解不均引起的团聚。

图1 扫描电镜图Figure 1 SEM image

该温敏凝胶主要用于ESD术后修复,液体的流动性是评价指标之一。从图2可以看出,凝胶在4℃和室温下保持液态且具有较好的流动性,在生理温度下形成凝胶,方便保存的同时避免反复冻融。当凝胶用于ESD时,需要通过内镜管道送至创面点,常温下具有很好的流动性,便于凝胶的输送。在37℃下原位成胶粘附于创面表面,可以精准定位并阻挡有害物质进一步损伤创面。

2.2 凝胶成胶时间

凝胶成胶时间结果如图3,凝胶在37 ℃静置1 min,样品倾斜45°,凝胶流动性较好,随着时间的延长凝胶开始逐渐凝胶化,在3 min时,凝胶倾斜45°,瓶内液体不流动,将瓶口倒置15 s内液体未有挂壁现象产生,说明此刻凝胶已完全固化。

图3 凝胶在37 ℃不同时间凝胶流动性Figure 3 Gel fluidity at 37℃ for different time

2.3 初始成胶温度

初始化凝胶温度结果见图4。G′和G″分别是储能模量和损耗模量,储能模量G′代表与应变一致的部分,可以衡量一个循环中以弹性形式储存的能量,损耗模量G″代表与应变不一致的部分,即黏性部分,表示循环中损失的能量[19]。随温度的升高,G′逐渐增大随后与G″相交并逐渐超过G″。当G″>G′时,样品处于液体状态;当G′=G″,样品由溶胶状态转变为凝胶,此刻的温度为初始凝胶温度,在35 ℃左右。当G″

图4 温敏凝胶在不同温度下扫描的流变图Figure 4 Rheological diagram of thermo-sensitive gel at different temperatures

2.4 凝胶体外溶胀实验

溶胀度是评价水凝胶表征的重要指标之一。研究发现(图5),样品的溶胀度先升高后降低,在24 h达到最大值238%,而后溶胀度逐渐降低,在48 h后趋于稳定,60 h溶胀率降至180%。在溶胀初期,凝胶的吸水溶胀能力大于降解能力,凝胶的溶胀度呈升高趋势。在24 h时达到最大值。随后凝胶解离速率大于溶胀速率,凝胶的溶胀度开始降低。48 h后凝胶的解离速率变缓,吸水溶胀能力和降解能力接近平衡,凝胶的溶胀度逐渐趋于稳定。

图5 样品在不同时间的溶胀度Figure 5 Swelling of gel at different times

2.5 凝胶浸提液对CCD 841 CoN细胞增殖的影响

2.5.1 浸提时间对CCD 841 CoN细胞增殖的影响

如图6所示,样品浸提24 h与浸提48 h和72 h相比有显著性差异(P<0.05),而浸提48 h和72 h二者之间无统计学差异(P>0.05),凝胶在浸提24 h时,对CCD 841 CoN细胞的增殖效果最好,因此选用浸提24 h后的浸提液用于后续实验。

图6 凝胶浸提不同时间对细胞增殖的影响Figure 6 Effect of different extraction time on cell proliferation

2.5.2 浓度对CCD 841 CoN细胞增殖的影响

用CCK-8法测不同浓度凝胶浸提液对细胞活性的影响(图7)。研究发现,与无血清对照组相比,在培养1 d时,各实验组无明显差异(P>0.05),培养2~3 d时,实验组细胞活力相较于对照组明显增高,其中50%组相较于25%、12.5%、6.25%组在2~3 d均具有显著差异(P<0.001),而与100%组相比无明显变化,由此发现,凝胶浸提液促进CCD 841 CoN细胞增殖效果的最佳浓度为50%。

图7 样品浸提24 h对细胞增殖影响Figure 7 Effect of gel extraction for 24 h on cell proliferation

2.6 浸提液对细胞迁移能力的影响

由图8和图9可知,培养不同时间对照组和样品组细胞迁移率均有统计学差异(P<0.01);培养24 h时,12.5%组细胞迁移率达54.9%,而阴性对照组仅为19.6%;培养36 h,12.5%组细胞迁移率达到67.5%,阴性对照组迁移率为27.1%。通过以上研究发现不同浓度浸提液促进细胞迁移具有浓度依赖性,随着浓度的升高而降低,浸提液浓度为12.5%时促进细胞迁移效果最好。

图8 样品浸提24 h对细胞迁移影响Figure 8 Effect of gel extraction for 24 h on cell migration

图9 不同浓度浸提液对CCD 841 CoN细胞迁移的影响Figure 9 Effects of different concentrations of extracts on CCD 841 CoN cells migration

3 讨论

内镜下黏膜切除术后创面直径<2 cm,可以使用止血夹关闭,当直径>2 cm时,目前无任何保护措施,裸露的创面导致并发症发生率明显增加,如食道狭窄、出血、穿孔、创面愈合不良,胃肠道出血、穿孔、腹痛、感染等并发症。ESD术后会暴露出较大的创面,当黏膜受损严重时,黏膜的保护力度不足以抵抗攻击因子的攻击;当机械力切除黏膜层时,机体产生应激,副交感神经-垂体-肾上腺素系统兴奋性提高,消化道消化液的分泌增加等都会加重溃疡的产生[20-21]。目前存在的材料停留在保护创面损伤方面,尚未出现同时满足保护创面和促进黏膜愈合的生物材料。因此课题组制备了一种复合型的材料,并对其理化性能和有效性进行研究。离子温度双敏型黏膜保护胶是通过内窥针喷洒到创面,因此需要有很好的流动性。根据对其流变性进行研究(图2、图3),发现该凝胶具有温度敏感性,低于室温的温度时流动性较好。要使凝胶能够在黏膜剥离后保护并修复伤口,水凝胶必须能够在生理温度下迅速原位成胶。研究发现,初始凝胶温度在35℃左右(图4),凝胶内部是一个致密结构,它能够在生理温度下原位成胶且能够有效阻挡有害物质进一步侵袭。作为一种修复材料,凝胶的吸水溶胀度对细胞生长也有一定的影响。体外溶胀度实验表明,该样品凝胶溶胀度最大值达到238%,可吸收一定量的浸出液,除此之外具有一定的保湿效果,有利于细胞的生长。重要的是,该凝胶能够促进CCD 841 CoN细胞增殖(图7)和迁移(图8)。溃疡产生后修复效果主要包含两个方面,其一是受损细胞脱落,健康未受损的细胞向受损部位迁移,其二是正常细胞的增殖,重新建立新的组织结构[22-25],而该凝胶浸提液在增殖和迁移方面均有很好的效果,因此可以认为该凝胶对ESD术后创面损伤有一定的修复效果。

4 结论

离子温度双敏感型黏膜保护胶是一种细胞相容性较好的高分子生物材料,该凝胶具有很好的低温流动性且在生理温度下能迅速原位成胶,制备的水凝胶可满足消化道伤口治疗和修复的要求。该水凝胶显示出极好的前景,可以作为一种术中生物材料,用来解除病变并促进ESD的修复。

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