复方雪莲烧伤膏对深Ⅱ度烫伤创面愈合的作用及机制

任雨洁，罗锦花，詹剑华

(南昌大学第一附属医院烧伤科，南昌 330006)

烧伤是临床上较为常见的外伤，烧伤创面愈合是一个极其复杂的生物过程，有效地修复创面一直是临床外科相关研究的重点之一。传统中医药作为我国的民族瑰宝及文化遗产，在创面修复治疗方面历史悠久，中医的“祛腐生肌”理论一直指导着中医外科的临床研究与经验传承，复方雪莲烧伤膏是中药和藏药相结合的烧伤治疗药膏，有促进创面愈合的作用，临床上多用于烧烫伤的创面治疗[1]。本研究采用大鼠深Ⅱ度烫伤模型，探讨复方雪莲烧伤膏对深Ⅱ度烫伤创面愈合的作用及其机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

选取70只成年清洁级SD大鼠,雌雄各35只,体重(210±20)g,由南昌大学江西医学院动物实验中心提供。分笼饲养，室内温度为20～25 ℃，自由摄食。复方雪莲烧伤膏：福建省三明天泰制药有限公司；烧伤湿润膏：汕头市美宝制药有限公司；凡士林：南昌白云药业有限公司。

1.2 建模方法

采用随机数字表法将SD大鼠分成4组：A组(假烫伤组)10只、B组(单纯烫伤组)20只、C组(烧伤湿润膏阳性对照组)20只、D组(复方雪莲烧伤膏组)20只。致伤前12 h禁食，腹腔注射5%盐酸胺碘酮(2 mL·kg-1)，待充分麻醉后，背部去毛，称重，108 ℃、时间设计为4 s蒸汽烫伤，造成约10%的烫伤创面。伤后1 h，取创面皮肤组织做HE染色，观察是否形成深Ⅱ度烫伤创面。伤后经腹腔注射乳酸林格液(40 mL·kg-1)，避免大鼠伤后因休克死亡。于造模后第4、7、10、14天，B、C、D组各取5只活杀取材，A组活杀2只取材，备用。

1.3 给药方法

每天上、下午定时换药2次，创面用生理盐水清洗后，分别外敷给药，B组给予创面外敷凡士林厚度约2 mm；C组给予创面外敷烧伤湿润膏厚度约2 mm；D组给予创面外敷复方雪莲烧伤膏厚度约2 mm；再用消毒纱布包扎固定。A组不做任何处理。

1.4 观察指标及检测方法

观察各组创面愈合时间和创面愈合率，检测各观察时点的创面组织含水量、CD68巨噬细胞含量、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGFmRNA相对表达量以及bcl-2、Bax蛋白表达水平。

创面愈合率:在大鼠烧伤后的第4、7、10、14天使用涤纶投影膜描计创面大小,利用图像分析软件计算出创面愈合率。创面愈合率=[(原始创面面积-残余创面面积)/原始创面面积]×100%[2]。

创面组织含水量:分别在各时相点取烫伤大鼠创面全程皮肤,先用滤纸把血液吸干,称湿重,再将皮肤组织用80 ℃烤箱烘烤24 h,称干重。创面组织含水量=[(湿重-干重)/干重]×100%。

CD68巨噬细胞含量和不同时间点创面组织中VEGF表达：采用免疫组织化学方法检测。

创面组织中VEGFmRNA的相对表达量：采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)方法检测。

B、C、D组创面组织及A组皮肤组织中bcl-2、Bax蛋白表达水平：采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组深Ⅱ度烫伤创面愈合时间比较

D组创面愈合时间为(18.4±2.1)d，短于C组的(19.8±1.7)d以及B组的(22.08±1.2)d，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组深Ⅱ度烫伤创面愈合率比较

D组创面愈合率明显高于B、C组(P<0.05)，见表1。

2.3 各组深Ⅱ度烫伤创面组织含水量比较

D组创面组织含水量明显少于B、C组(P<0.05)，见表2。

表2 各组深Ⅱ度烫伤创面组织含水量比较

2.4 各组CD68巨噬细胞含量比较

D组的CD68巨噬细胞含量低于A组，高于B、C组(P<0.05)，说明D组的CD68巨噬细胞含量调控在一定范围内。见表3。

表3 各组CD68巨噬细胞含量比较 个·视野-1

2.5 各组创面组织VEGF含量比较

D组创面组织VEGF含量明显高于A、B、C组(P<0.05)，见表4。

表4 各组创面组织VEGF含量比较阳性信号数/400×光镜视野

2.6 各组创面组织中VEGFmRNA的相对表达量

D组创面组织中VEGFmRNA的相对表达量明显高于A、B、C组(P<0.05)，见表5。

表5 各组创面组织中VEGFmRNA的相对表达量拷贝数·g-1

2.7 各组创面组织bcl-2蛋白表达水平

D组的bcl-2蛋白表达水平高于A、B、C组(P<0.05)，见表6。

表6 各组创面组织bcl-2蛋白表达水平

2.8 各组创面组织Bax蛋白表达水平

D组的Bax蛋白表达水平低于A、B、C组(P<0.05)，见表7。

表7 各组创面组织Bax蛋白表达水平

3 讨论

烧伤是全球范围内的四大外伤之一,严重影响着人们的日常生活。烧伤创面因其严重程度不同,愈合时间也不相同,深Ⅱ度烧伤创面较深，伤及真皮乳头层以下但仍残留部分真皮层，创面愈合依靠创面边沿和烧伤区残留的皮肤附件上皮增殖形成上皮小岛，皮岛再拓展覆盖创面。目前现代医学促进烧伤创面愈合的手段主要为应用细胞因子、研制与应用新型敷料、应用组织工程皮肤等以及物理治疗。但这些方法各有利弊。对于选择保守治疗的患者,外用药物的选择是创面愈合以及治疗结局的关键。湿润烧伤膏是治疗烧伤的经典药物,外部涂抹后通过促进肉芽组织增殖分化等机制促进创面愈合[3]。复方雪莲烧伤膏是根据中医医学理论研制而成,主要含有雪莲花、西红花、熊胆、麝香、紫草、冰片等中药,这些药物联合使用可以达到去腐生肌、消肿止痛和抗炎抑菌的作用,还可以使创面渗出减少,具有较强的收敛效果[4]。本研究结果显示,复方雪莲烧伤膏较之湿润烧伤膏在缩短创面愈合时间和减少渗出方面有一定的改善,组间差异有统计学意义。众所周知,血管生成与重建是创面愈合的两个关键因素,而VGEF作为血管形成中不可忽视的刺激因子细胞，影响着血管生成过程，并在此过程中发挥着中枢性的调控作用；另一方面,细胞凋亡是创面愈合中一种重要的生物学现象,而在此调控过程中bcl-2家族起到了关键性作用，其中bcl-2蛋白起到抑制凋亡作用,而Bax蛋白是促进凋亡蛋白。巨噬细胞被称为创面修复的“调控细胞”,不仅可以清除坏死细胞、趋化修复细胞，还可以刺激新生毛细血管形成以及成纤维细胞增殖。CD68是巨噬细胞重要膜表面分子,可标志着巨噬细胞的存在。

相关研究[5]表明,在深Ⅱ度烧伤治疗中,复方雪莲烧伤膏可减少创面渗液量,促进创面愈合,减少瘢痕的发生,且安全性良好。本研究表明,D组愈合时间短于B、C组(P<0.05)，创面愈合率D组(79.8%)明显高于C组(48.6%)(P<0.05)，D组创面组织含水量明显少于B、C组(P<0.05)，与上述研究[5]结果一致。A组皮肤组织同B、C、D组烧伤创面组织VEGF含量以及VEGFmRNA表达量相比,D组明显高于其余3组(P<0.05)；D组的bcl-2蛋白表达水平明显高于其余各组(P<0.05),而Bax蛋白表达水平低于其余各组(P<0.05)。目前人们对巨噬细胞在创面修复过程中所起作用意见不一,部分研究[6]表明巨噬细胞可以促进创面愈合,而MORSI等[7]认为巨噬细胞通过引起炎症反应而不利于创面愈合。本研究发现复方雪莲烧伤膏对巨噬细胞的数量有影响,可调控巨噬细胞数量在一定范围从而参与烧伤创面愈合过程。本研究运用多种现代科学技术,探讨了复方雪莲烧伤膏促进创面愈合的机制,为该药在临床的应用提供依据,为促进创面愈合提供治疗手段。本研究仅在新鲜创面上进行实验,而临床上多存在经久不愈的创面,且复方雪莲烧伤膏针对难愈性创面的疗效和机制如何，尚无详细报道，故计划在未来进行拓展研究。

综上所述,复方雪莲烧伤膏治疗深Ⅱ度烧伤创面是通过调控巨噬细胞含量,促进VEGF分泌、VEGFmRNA的表达,上调bcl-2的同时下调Bax蛋白来减少创面渗液量,从而促进创面愈合。