miR-219-5p对人肾癌细胞增殖和迁移、侵袭的影响及其作用机制

王晓燕，冯景见，何英霞，李 康，李 鑫

(石家庄市人民医院肿瘤科五病区，石家庄 050000)

肾细胞癌(肾癌)是泌尿系最常见的肿瘤之一，占肾脏恶性肿瘤的80%以上[1]。肾癌约有25%的患者在诊断时出现转移，30%的患者在根治性肾癌切除术后出现转移[2]。因此，探索与肿瘤发生和进展相关的生物标志物可能会改善肾癌的潜在治疗策略和预后。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类内源性非编码小RNA，转录后通过抑制mRNA的翻译或促进其降解来抑制靶基因的表达[3]。miRNA的失调已被证明在包括肾癌在内的各种癌症的发生发展过程中发挥重要作用[4-5]。有研究[6-7]表明，miR-219-5p在肝癌、肺癌中下调表达，miR-219-5p在癌细胞中主要作为抑癌基因来发挥作用，但目前miR-219-5p对肾癌的影响还未可知。另研究[8-9]发现NIMA相关激酶6(NEK6)在卵巢癌、肝癌中上调表达，是影响癌症预后的重要因素。本研究生物信息学预测显示，NEK6可能是miR-219-5p的下游靶基因。基于此，本研究探讨miR-219-5p在肾癌中的表达，以及在肾癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，旨在探索其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

肾癌细胞786-O、ACHN购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，肾上皮细胞HEK293购自上海雅言生物科技有限公司，RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，荧光素酶报告载体、miR-219-5p、anti-miR-219-5p、si-NEK6、pcDNA3.1-NEK6及各自阴性对照购自上海GenePharma公司，实时荧光定量PCR(qPCR)相关检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、P21、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，NEK6抗体购自上海艾博抗公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 临床组织标本

30例肾癌组织和癌旁组织(距离肾癌组织≥3 cm 的正常组织)来源于石家庄市人民医院2015年6月至2019年5月接受手术治疗的肾癌患者，其中女13例，男17例；年龄30～74岁，平均53岁。所有患者术前未接受任何放、化疗。组织标本离体后立即于液氮中冻存，用于qPCR检测和蛋白质印迹法(Western blot)。

1.3 qPCR检测miR-219-5p表达

为了检测miR-219-5p表达，使用TRIzol试剂提取肾癌组织或细胞中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明，制成cDNA之后进行qPCR反应，根据2-ΔΔCt方法量化miR-219-5p表达。miR-219-5p上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAAACGC-3′，下游引物序列为5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；内参U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 细胞培养与转染

786-O、ACHN细胞置于包含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2条件下孵育，每周换液2～3次，进行常规传代培养。细胞转染24 h前，将786-O和ACHN细胞接种于6孔板，达约70%汇合时，根据Lipofectamine 2000试剂说明书的指示，将miR-219-5p、anti-miR-219-5p、si-NEK6、pcDNA3.1-NEK6及各自阴性对照转染到两株细胞中，培养48 h。收集转染后的细胞，根据“1.3”所述方法测定786-O和ACHN细胞中miR-219-5p水平，并进行其他指标检测。

1.5 噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖

将密度为1×104个·mL-1的786-O、ACHN细胞接种于96孔板，培养48 h后每孔加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜200 μL，摇床震荡培养10 min，酶标仪读取每孔细胞的吸光度(OD)值，检测波长为490 nm，并根据公式计算细胞存活率：存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.6 细胞克隆实验

收集转染后的786-O和ACHN细胞，以1000个细胞·孔-1的密度置于6孔板中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿润的培养箱中培养14 d。当出现肉眼可见的细胞克隆时，使用1:1甲醇和丙酮固定，5%龙胆紫染色后计数。

1.7 Transwell检测细胞迁移、侵袭

在两株细胞迁移和侵袭能力检测时，使用无血清RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×105个·mL-1，吸取100 μL于上室(检测细胞侵袭时，实验前使用无血清培养基与Matrigel胶混匀包被上室)，吸取500 μL包含血清的RPMI 1640培养基于下室。培养24 h后，甲醛和结晶紫分别进行染色、固定，之后于显微镜下观察，拍照、计数。

1.8 Western blot检测

收集肾癌组织或转染后的786-O和ACHN细胞，加入裂解液提取蛋白，蛋白样品沸水变性后进行10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，蛋白分离后转至聚偏氟乙烯膜，加入5%脱脂奶粉封闭，加入1:1000稀释的NEK6、Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2、NEK6及内参照GAPDH抗体，于4 ℃条件下孵育过夜，Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)洗脱3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育2 h，经ELC显色、显影，分析蛋白条带灰度值。

1.9 双荧光素酶报告实验

starBase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测miR-219-5p的靶基因，发现NEK6的3’非编码区域(3’untranslated region，3’UTR)含有与miR-219-5p互补的核苷酸序列。分别构建包含miR-219-5p结合位点的NEK6野生型(WT-NEK6)及突变型(MUT-NEK6)荧光素酶报告质粒，并利用Lipofectamine 2000试剂分别与miR-219-5p、miR-NC共转染，转染48 h后依据双荧光素酶检测试剂盒的指示检测双荧光素酶活性。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 miR-219-5p、NEK6在肾癌组织和细胞中的表达

qPCR和Western blot检测结果显示，与癌旁组织比较，肾癌组织中miR-219-5p表达量[(0.17±0.02)比(1.03±0.10)，P<0.05]明显减少，NEK6蛋白表达量[(0.90±0.08)比(0.28±0.03)，P<0.05]显著增加；与肾上皮细胞比较，786-O、ACHN肾癌细胞株中miR-219-5p表达量[(0.18±0.02)、(0.27±0.03)比(1.01±0.10)，P<0.05]明显减少，NEK6蛋白表达量[(0.93±0.08)、(0.78±0.07)比(0.31±0.03)，P<0.05]显著增加，见图1。

A：miR-219-5p在肾癌组织中的表达；B：NEK6在肾癌组织中的表达；C：miR-219-5p在肾癌细胞中的表达；D：NEK6在肾癌细胞中的表达；*P<0.05与癌旁组织比较；#P<0.05与肾上皮细胞比较。

2.2 过表达miR-219-5p对肾癌细胞786-O、ACHN增殖、迁移、侵袭的影响

Transwell检测结果表明，过表达miR-219-5p组比miR-NC组明显减少786-O、ACHN细胞的迁移细胞数[(87.00±5.84)个比(186.00±16.10)个、(93.00±6.14)个比(166.00±15.21)个，P<0.05]和侵袭细胞数[(50.00±5.11)个比(107.00±11.30)个、(54.00±5.26)个比(89.00±7.23)个，P<0.05](图2A—B)。Western blot检测结果显示，同miR-NC组相比，过表达miR-219-5p组显著降低786-O、ACHN细胞的Cyclin D1[(0.14±0.01)比(0.79±0.08)、(0.22±0.02)比(0.71±0.07)，P<0.05]、MMP-2[(0.31±0.03)比(0.84±0.08)、(0.37±0.04)比(0.77±0.08)，P<0.05]蛋白表达水平，明显增加P21[(0.61±0.06)比(0.20±0.02)、(0.56±0.06)比(0.24±0.02)，P<0.05]、E-cadherin[(0.68±0.07)比(0.17±0.02)、(0.58±0.05)比(0.21±0.02)，P<0.05]蛋白表达水平(图2C—D)。qPCR检测结果发现，786-O、ACHN细胞中转染miR-219-5p后，miR-219-5p表达量明显高于miR-NC组(P<0.05)，见表1。MTT和细胞克隆检测结果显示，与miR-NC组比较，过表达miR-219-5p显著降低786-O、ACHN细胞的存活率和克隆数(P<0.05)，见表1。

A：过表达miR-219-5p对肾癌细胞786-O迁移、侵袭的影响；B：过表达miR-219-5p对肾癌细胞ACHN迁移、侵袭的影响；C：786-O中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；D：ACHN中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；*P<0.05与miR-NC组比较。

表1 过表达miR-219-5p对肾癌细胞786-O、ACHN存活率和克隆数的影响

2.3 miR-219-5p靶向、调控NEK6

starBase网站预测发现，miR-219-5p与NEK6部分碱基序列可形成互补配对(图3A)。Western blot检测结果表明，与miR-NC组比较，miR-219-5p组786-O、ACHN细胞的NEK6蛋白表达水平[(0.36±0.03)比(0.91±0.09)、(0.20±0.02)比(0.72±0.07)，P<0.05]明显减少；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-219-5p组NEK6蛋白表达水平[(1.41±0.14)比(0.88±0.09)、(1.09±0.10)比(0.71±0.07)，P<0.05]显著提高(图3B)。双荧光素酶报告实验结果发现，与miR-NC和WT-NEK6共转染786-O细胞相比，miR-219-5p和WT-NEK6共转染明显降低细胞的荧光素酶活性(P<0.05)，而miR-NC或miR-219-5p分别和MUT-NEK6共转染细胞后，细胞的荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)，见表2。

A：NEK6的3’UTR含有miR-219-5p的互补序列；B：miR-219-5p调控NEK6的表达；*P<0.05与miR-NC组比较；#P<0.05与anti-miR-NC组比较。

表2 双荧光素酶报告实验结果

2.4 抑制NEK6对肾癌细胞786-O、ACHN增殖、迁移、侵袭的影响

与si-NC组比较，抑制NEK6明显减少786-O、ACHN细胞的迁移细胞数[(96.00±6.89)个比(187.00±12.80)个、(102.00±6.74)个比(167.00±15.53)个，P<0.05]和侵袭细胞数[(59.00±6.14)个比(108.00±11.50)个、(63.00±5.28)个比(90.00±7.23)个，P<0.05]，以及显著降低NEK6[(0.41±0.04)比(0.91±0.09)、(0.32±0.03)比(0.80±0.07)，P<0.05]、Cyclin D1[(0.29±0.03)比(0.81±0.08)、(0.34±0.03)比(0.70±0.07)，P<0.05]、MMP-2[(0.44±0.04)比(0.81±0.08)、(0.41±0.04)比(0.78±0.08)，P<0.05]蛋白表达水平，显著提高P21[(0.50±0.05)比(0.22±0.02)、(0.51±0.05)比(0.25±0.02)，P<0.05]、E-cadherin[(0.47±0.05)比(0.19±0.02)、(0.48±0.05)比(0.22±0.02)，P<0.05]蛋白水平，并且显著降低细胞存活率、克隆数(P<0.05)。抑制NEK6对786-O、ACHN细胞中miR-219-5p表达无显著影响(P>0.05)。见图4、表3。

A：抑制NEK6对786-O细胞迁移侵袭的影响；B：抑制NEK6对ACHN细胞迁移侵袭的影响；C：786-O细胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；D：ACHN细胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；*P<0.05与si-NC组比较。

表3 抑制NEK6对肾癌细胞786-O、ACHN存活率和克隆数的影响

2.5 过表达NEK6能逆转miR-219-5p对肾癌细胞786-O、ACHN的增殖

与miR-219-5p和pcDNA3.1共转染比较，miR-219-5p和pcDNA3.1-NEK6共转染的786-O、ACHN细胞中NEK6[(0.79±0.08)比(0.37±0.04)、(0.75±0.06)比(0.33±0.03)]、Cyclin D1[(0.63±0.06)比(0.13±0.01)、(0.60±0.06)比(0.22±0.02)]蛋白表达水平显著增加，P21[(0.33±0.03)比(0.60±0.06)、(0.35±0.03)比(0.56±0.06)]蛋白表达水平显著降低，且显著提高细胞存活率和克隆数(P<0.05)，见图5、表4。

A:786-O细胞NEK6、Cyclin D1、P21蛋白的表达；B：ACHN细胞NEK6、Cyclin D1、P21蛋白的表达；*P<0.05与miR-219-5p+pcDNA3.1转染比较。

表4 过表达NEK6能逆转miR-219-5p对肾癌细胞786-O、ACHN存活率和克隆数的影响

2.6 过表达NEK6能逆转miR-219-5p对肾癌细胞786-O、ACHN迁移、侵袭的影响

相比于miR-219-5p和pcDNA3.1共转染，miR-219-5p和pcDNA3.1-NEK6共转染的786-O、ACHN细胞的迁移细胞数[(171.00±9.78)个比(88.00±6.36)个、(150.00±9.95)个比(91.00±6.13)个，P<0.05]和侵袭细胞数[(97.00±8.94)比(52.00±5.22)个、(80.00±7.94)比(53.00±5.17)个，P<0.05]显著减少，同时细胞中E-cadherin蛋白表达量[(0.29±0.03)比(0.70±0.07)、0.26±0.03)比(0.56±0.05)，P<0.05]显著降低，MMP-2蛋白水平[(0.68±0.07)比(0.29±0.03)、(0.63±0.06)比(0.39±0.04)，P<0.05]显著增加，见图6。

A：过表达NEK6能逆转miR-219-5p对肾癌细胞786-O迁移侵袭的影响；B：过表达NEK6能逆转miR-219-5p对肾癌细胞ACHN迁移侵袭的影响；C:786-O细胞E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；D：ACHN细胞E-cadherin、MMP-2蛋白的表达；*P<0.05与miR-219-5p+pcDNA3.1转染比较。

3 讨论

肾癌是泌尿系恶性肿瘤的第二大致死原因。2018年，全球约有40.3万例新的肾癌病例发生，造成17.5万人死亡[10]。据统计[11]，2014年我国肾癌约有6.83万例新发病例，2.56万例死亡病例。在过去的30年中，肾癌患者总体5年生存率从50%提高到74%，这种改善主要归因于肾癌早期诊断的比例不断增加，而医学成像使用的日益增加促进了这种诊断[12-13]。虽然早期发现有所改善，但晚期或转移性肾癌的治疗仍然有限，部分原因是高复发率和远处转移。因此，阐明肾癌转移的机制，以发现重要的生物标志物并制定新的治疗策略具有重要意义。

miRNA在各种类型的癌症中扮演着癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤的发生、转移和对化疗的敏感性或耐药方面起着至关重要的作用[14-16]。据报道[17]，miR-219-5p在结直肠癌等一些人类肿瘤中异常表达，是潜在的肿瘤抑制剂。miR-219-5p在胃癌组织和细胞系中明显低于癌旁组织和正常胃上皮细胞，miR-219-5p过表达显著降低了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]。miR-219-5p的表达可通过靶向高迁移率族蛋白A2(HMGA2)抑制卵巢癌细胞系SKOV3的增殖、侵袭和迁移，并在体内显著抑制肿瘤的生长[19]。miR-219-5p在黑色素瘤组织和细胞系中的表达明显降低，miR-219-5p水平低的患者总体生存率明显较低，miR-219-5p的上调通过靶向Bcl-2抑制黑色素瘤的生长和转移，增强黑色素瘤细胞的化学敏感性[20]。miR-219-5p在结直肠癌组织中表达明显下调，过表达抑制结直肠癌HCT-8细胞的生长和侵袭，起到抑癌作用[21]。然而，miR-219-5p在肾癌中的表达及生物学功能尚未可知。本研究中，qPCR检测数据表明，肾癌组织或细胞中miR-219-5p表达量明显减少，过表达miR-219-5p显著减少786-O和ACHN细胞的存活率、克隆数、迁移细胞数和侵袭细胞数，并显著降低Cyclin D1、MMP-2蛋白表达，提高P21、E-cadherin蛋白表达，说明与前述报道相同，miR-219-5p在肾癌中同样充当抑癌基因，可以抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭，可能有助于为肾癌患者识别新的生物标志物和治疗靶点。

NEK6是一种蛋白激酶，参与细胞周期调控、凋亡、衰老和耐药等多种细胞过程，成为新型抗癌药物开发的有吸引力的靶标[22-23]。HE等[24]采用免疫组织化学和Western blot方法分析133例乳腺癌标本中Nek6的表达谱，发现与邻近的非肿瘤组织相比，大多数乳腺癌标本中的NEK6表达上调，能够促进乳腺癌细胞增殖。徐继等[25]检测到NEK6 mRNA水平在胃癌组织和细胞内明显高于癌旁组织和正常胃黏膜上皮细胞，敲减NEK6表达使胃癌细胞迁移和侵袭能力明显减弱。这些研究表明，NEK6可能作为癌基因促进肿瘤的发生发展。本实验中，NEK6蛋白水平在肾癌组织或细胞中显著增加，抑制NEK6明显降低肾癌786-O和ACHN细胞中Cyclin D1、MMP-2蛋白表达，显著提高P21、E-cadherin蛋白水平，并且明显减少细胞存活率、克隆数、迁移细胞数和侵袭细胞数，与前人研究[25]相符。

miRNA通过与靶基因特异性结合，发挥基因调控功能。如miR-219-5p在卵巢癌中靶向HMGA2[19]，在黑色素瘤中靶向Bcl-2[20]，参与癌症病理演进过程。在视网膜母细胞瘤中，长链非编码RNA HOXA11-AS可以作为竞争性内源RNA来抑制miR-506-3p表达，从而调节下游靶基因NEK6[26]。NEK6被证明是miR-23a的靶标，介导小檗碱诱导的抗肝癌作用[27]。本研究的生物信息学和双荧光素酶报告实验证实，NEK6是miR-219-5p的下游靶基因，其蛋白水平明显被miR-219-5p所调控。进一步的功能实验结果显示，过表达NEK6逆转了miR-219-5p抑制肾癌细胞786-O、ACHN增殖、迁移、侵袭、Cyclin D1、MMP-2蛋白表达的作用，以及逆转了miR-219-5p促进P21、E-cadherin蛋白表达的作用，说明miR-219-5p通过直接靶向调控NEK6的表达，从而影响肾癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，miR-219-5p在肾癌组织中表达下调，过表达miR-219-5p可以抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与靶向调控NEK6表达密切相关，这为肾癌发病和转移机制的深入探索提供了新的思路。