深静脉血栓关键基因AP2B1和miRNAs及其相关通路的筛选

祁莎莎 曹鑫 徐宁宁 陈静

0 引言

深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)是常发生在下肢深静脉的血栓栓塞性疾病，在临床较为常见，起病隐匿，发病凶险。然而目前诊断DVT的金标准为有创血管显影，患者接受度低，并且增加术前紧张度，影响手术效果。因此及时准确、有效特异地诊断DVT并给予干预措施，在临床工作中具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种稳定存在于血清中的高度保守的内源性非编码小RNA，含量丰富，且不易被降解，在静脉血栓栓塞性疾病中起重要作用[1]，其参与到血栓形成的多个环节[2]，作为一种新型非侵入性诊断标志物用于血栓性疾病的诊断及预后。越来越多的研究证实，miRNAs参与到DVT的形成发展中，有研究表明上调miR-664b-3p表达抑制Caspase-1介导细胞的焦亡，保护血管内皮，抑制深静脉血栓形成[3]；同样地，在DVT动物模型中发现miR-5189-3p 与JAG1、Notch1和 Hes1的表达量呈正相关，通过激活Notch信号通路促进内皮细胞增殖分化，抑制DVT形成[4]；在混合型 DVT 患者中检测到miR-374a-5p存在高表达，可增加患者远期血栓后综合征的发生率及严重水平[5]。近年来，生物信息学技术迅速发展，不仅可以预测靶基因及miRNAs，还可通过在线数据库进行KEGG信号通路富集分析，可以提供潜在精确的生物靶标。鉴于目前对miRNAs参与静脉血栓形成进展的作用尚处于探索阶段，如何精准靶定关键基因，得出相应的miRNAs，可为后续临床检测提供快速精确的理论指导。因此，研究组基于GEO数据库对DVT的关键基因及其相关miRNAs进行研究，并对其进行信号通路富集分析，以期为临床诊断深静脉血栓提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 深静脉血栓关键基因预测

利用GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)在线数据库中GSE17078数据集,将数据库收录的人深静脉血栓病例分为NC组(正常对照组，27例)及DVT组(实验组，3例)，筛选其中log2(fold change)>1的差异基因，其中P值最小的作为关键基因。

1.2 深静脉血栓关键基因的器官富集分析

分析基因AP2B1在不同器官中的富集程度，通过Networkanalyst(www.networkanalyst.ca)网站对关键基因进行器官富集分析。

1.3 深静脉血栓关键基因的miRNA预测

应用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://mirdb.org/)及mirTARBASE(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)在线数据库预测AP2B1基因的miRNAs，并利用Venn图对DVT关键基因的miRNAs取交集。

1.4 深静脉血栓关键基因相关miRNA的信号通路预测

为进行miRNAs的功能分析，通过mirTARBASE在线数据库对AP2B1相关的miRNAs的靶基因进行GO分析和信号通路KEGG富集分析。

1.5 深静脉血栓关键基因AP2B1的PPI网络构建及PPI网络中基因的GO和KEGG分析

通过STRING网站(https://string-db.org/)对DVT关键基因AP2B1进行PPI网络构建，得出与AP2B1基因编码所对应的蛋白互作图；并对PPI网络中的基因进行GO分析、信号通路KEGG富集分析。

1.6 动物实验验证AP2B1及miRNA差异表达

利用RT-PCR法检测DVT组和NC组大鼠的AP2B1及其相关miRNAs的表达量，以验证生物信息学的预测结果。

1.6.1 DVT大鼠模型的建立和分组

10只SPF级雄性SD大鼠(年龄 8～12周,体质量200～300 g)，购自山东第一医科大学动物实验中心。5只作为NC组，5只用于模型建立作为DVT组。适应性喂养1周后，使用“定量击打+外部石膏固定”方法建立 DVT 大鼠模型。大鼠俯卧位固定，使用自制定量击打装置对双侧大腿近心端进行能量击打引起股骨骨折，之后采用石膏固定。DVT组不进行任何治疗，造模结束后对大鼠实施安乐死，取大鼠股静脉组织进行检测。

1.6.2 RT-PCR技术检测两组SD大鼠股静脉组织中AP2B1基因及miRNA的表达量

根据 Trizol 试剂的说明从大鼠股静脉组织中提取总RNA。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司设计和合成。使用Prime Script RT试剂盒(AG艾科瑞生物公司)将获得的RNA反转录为cDNA。根据RT-PCR试剂盒(AG艾科瑞生物公司)的说明，使用 Thermo Quant Studio 5定量 PCR 仪(美国 Thermo公司)对 cDNA 进行实时荧光定量 PCR。通过(2 -ΔΔCt)法计算相对表达量。

2 结果

2.1 DVT关键基因分析

基于GEO数据库匹配的差异基因分析工具GEO2R，依据log2(fold change)>1且P<0.05筛选差异基因，根据P值排序，最小的前10个基因如表1；P值最小的差异基因AP2B1拟定为DVT关键基因。差异基因分析的火山图如图1所示；关键基因AP2B1在每个病例中的表达量如图2所示。

图2 GSE17078数据集中各样本的AP2B1的表达量统计Figure 2 Statistics of AP2B1 expression in each sample in GSE17078 data set

表1 排名前十的差异基因Table 1 The top ten differential genes

红色点代表上调基因；蓝色点代表下调基因；灰色点代表无显著差异的基因。图1 GSE17078差异基因分析火山图Figure 1 Volcano map of GSE17078

2.2 DVT关键基因AP2B1在器官中富集分析

通过NCBI网站可知该基因在不同器官的表达量，发现其在人脑中表达量最高，如图3所示；然后通过Networkanalyst网站对AP2B1基因与其他基因在脑中的共表达情况进行分析，发现海马体中与AP2B1相互作用的基因数量最多，并构建了该基因在海马体中的基因共表达网络，如图4所示。

图3 AP2B1基因在不同器官中的表达量Figure 3 Expression of AP2B1 in different organs

图4 海马体中与AP2B1基因共表达的基因互作图Figure 4 Gene interaction map of co-expression with AP2B1 gene in hippocampus

2.3 DVT关键基因的miRNA预测结果

经过TargetScan、miRDB及mirTARBASE 3个数据库预测关键基因AP2B1的miRNAs，并通过Venn图取交集后得出概率最大miRNAs分别是hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图5所示。

图5 miRNA的Venn图分析Figure 5 Venn diagram analysis of miRNA

2.4 DVT关键基因相关的miRNA信号通路预测结果

通过mirTARBASE数据库分析得出hsa-miRNA-4780相应的信号通路为0，推测其目前研究领域涉及极少，故仅对hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p进行mirTARBASE数据库分析，结果涉及TGF-β信号通路、细胞周期、RNA运输、内质网中蛋白加工等51个生物过程，其中显著富集于TGF-β信号通路、细胞周期及脂肪酸生物合成等16个信号通路中，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图6所示。

图6 hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p的KEGG通路富集分析热点图Figure 6 Hotspots of KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miRNA-106b-5p and hsa-miRNA-16-5p

2.5 DVT关键基因AP2B1的PPI网络构建及PPI网络中基因的GO和KEGG分析

通过STRING网站(https://string-db.org/)对关键基因AP2B1进行PPI网络构建，PPI构建图分析出AP2B1基因编码的蛋白质与AP1M1等10种蛋白质相互作用复杂，在体内起着十分重要的作用，如图7所示；并对PPI网络进行基因本体论GO分析和信号通路KEGG富集分析，发现其主要参与的GO过程分为分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)和细胞组成(cellular component)3个部分，其中在病毒防御、受体代谢等功能富集显著，如图8所示；其参与的KEGG通路为内吞作用和内分泌相关的钙离子重吸收等，如图9所示。

图7 关键基因AP2B1相关蛋白PPI图Figure 7 PPI map of key gene AP2B1 related proteins

图8 关键基因AP2B1蛋白互作网络基因的GO分析Figure 8 GO analysis of gene in protein interaction network of AP2B1

图9 关键基因AP2B1蛋白互作网络基因的KEGG分析Figure 9 KEGG analysis of gene in protein interaction network of AP2B1

2.6 DVT关键基因AP2B1及相应miRNA的RT-PCR结果

经RT-PCR检测发现，DVT组大鼠的股静脉组织中的AP2B1表达量低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；并且DVT组经预测得到的3种miRNAs的表达量显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，如图10所示。

图10 关键基因AP2B1及相应miRNAs的RT-PCR结果Figure 10 Results of RT-PCR of key gene AP2B1 and related miRNAs

3 讨论

DVT在手术患者中发生率较高，缺乏创伤小和特异性强的诊断方法。miRNA是天然存在的一种非编码RNA，可以调控mRNA的稳定性，参与调节多种生物功能[6]，成为最新的研究热点之一。近年来多项研究表明，miRNA参与血栓形成的多个环节，差异表达与DVT的症状有很强的相关性[7-8]。研究显示miRNA可参与调控血小板的功能[9]；与凝血因子XI、组织因子[10]及纤维蛋白原水平均密切相关，最终导致血栓性疾病的发生。研究表明利用miRNA作为预测性生物标志物可以应用于血栓性疾病的检测，其在DVT患者血液的表达存在明显的表达失调[11]。DVT患者中miRNA-21的低表达水平与复发性DVT和血栓后综合征的增加有关，联合现有血栓性指标可提高血栓性疾病的诊断准确性[12]。Thibord等[13]研究提供了有关miRNAs变异性对止血作用的影响的新数据，以及支持少数miRNAs与静脉血栓形成患者复发风险相关的新论点，产生了大量与血浆miRNAs和DVT相关的生物学/临床特征相关的信息，这些信息对于产生和验证新的假设非常有用。但研究的局限性在于miRNAs参与的信号通路介导的生物过程尚不明确，生物信息学可通过缩小目标范围，筛选靶基因，预测相应的miRNA及其可能参与的信号转导通路，并利用荧光标记、RT-PCR等实验技术进行验证，才能充分证明其可作为特异性生物标记物。

本研究利用在线数据库得出深静脉血栓的关键基因AP2B1，并预测与其密切相关的miRNAs分别是hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p，旨在探讨AP2B1在DVT中的生物学功能，并分析与其相关的miRNAs 在DVT中的改变，探索其作为DVT诊断标志物的可能性。DVT对脑组织的损伤作用是最为严重的[14]，本研究结果显示AP2B1在脑组织中含量最高，尤其在海马体中与之相互作用的基因最多，与Koscielny等[15]的研究结果部分一致。除此之外，数据库分析得出与AP2B1密切相关的hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p其KEGG分析的结果显示，主要显著富集于TGF-β信号通路、细胞周期及脂肪酸生物合成等16个信号通路中。miRNAs可以通过TGF-β信号通路调控基因的表达并参与肿瘤免疫微环境[16]；TGF-β信号通路包含miRNA通路，可作为其下游信号级联的重要组成部分[17]。因此，研究组推测与DVT密切相关的hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可通过TGF-β信号通路等信号通路调控AP2B1的表达，为临床治疗DVT提供新的靶向指导。为预测DVT关键基因AP2B1在体内的可能作用机制，研究组进一步对AP2B1进行PPI网络构建，发现其与AP1M1等10种蛋白质存在相互作用，在机体内起着重要作用；对其在PPI网络中互作的基因进行GO和KEGG分析，发现其主要的GO过程为病毒防御、受体代谢等功能；KEGG通路为内吞作用、内分泌相关的钙离子重吸收等。据此研究组推测AP2B1与AP1M1等蛋白质相互作用，可能与内吞作用等信号通路密切相关，在DVT的形成发展中发挥重要作用。已有研究[18]发现与内吞作用相关的AP2B1作为核心生物标记在帕金森病患者的脑脊液中显著降低，推测功能失调的蛋白质稳态可能是帕金森病的病理生理机制。最后经过动物实验证实了DVT模型大鼠中AP2B1表达量低于对照组，同时hsa-miRNA-4780、hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p的表达量高于对照组，与本研究预测结果一致。

4 结论

综上所述，本研究通过生物信息学方法对DVT进行关键基因和miRNAs预测，并对其进行GO功能分析、KEGG富集分析，结果预测hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可能通过TGF-β等信号通路调控关键基因AP2B1的表达，参与血栓形成的病理生理过程；同时预测出AP2B1与AP1M1等多种蛋白质之间存在复杂的相互作用，可能与内吞作用等功能有关，为进一步深入研究DVT发病机制及治疗靶点提供新的思路。hsa-miRNA-106b-5p及hsa-miRNA-16-5p可作为新型生物诊断标志物，在DVT有效的诊断与治疗中具有重要的临床价值。本研究在预测过程中难以避免存在一定的局限性，还需后续的生物学实验证实预测结果。