高效液相色谱法检测红参中人参皂苷及人参二醇的含量①

王 飞，蒋俊春，袁 力

(1.商丘市食品药品检验中心理化一室，河南 商丘 476000；2.河南省食品药品检验所微生物室，河南 郑州 450000)

红参属于名贵中药，由人参加工制成，具有复脉固脱、大补元气、益气摄血等功效[1]，主要成分为人参皂苷及强酸水解得到的人参二醇、人参三醇，红参主要成分含量是判断其质量优劣的重要指标之一[2]。随着近年来微波和超声波在化学成分提取中的应用越来越广泛，极大的缩短了提取时间，提高了有效成分提取率，且操作简便，避免了高温对有效成分的影响[3，4]。为更好的控制红参及其制剂的质量，本研究建立了高效液相色谱法测定红参中人参皂苷及人参二醇的含量，以期为其质量控制提供理论支持。

1 仪器与试剂、试药

1.1 仪器

Waters Acquity超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，FL9500色谱工作站；KQ2200E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，AUW220D型电子分析天平(日本岛津公司)；超纯水机(台湾艾柯纯水机公司)。

1.2 试剂、试药

人参皂苷对照品Rg1(批号：110703-202034)、Rg2(批号：111779-200801)、Rb1(批号：110704-202028)、Rb2(批号：11175-201203)、Rc(批号：201865)、Rf(批号：111719-201806)、人参二醇对照品(批号110701-201715)，来源：中国食品药品检定研究院。红参(产地河北)乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Ulitimate XB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～5min采用0～29%A洗脱，5～20min采用29%～36%A洗脱，20～22min采用36%～95%A洗脱，22～25min采用95%A洗脱。进样量5μL，流速0.30mL·min-1，柱温30℃，人参皂苷检验波长203nm，人参二醇检测波长230nm[5]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 精密称取人参皂苷对照品Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人参二醇对照品各约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液溶解后定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，精密量取上述溶液10mL，置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液定容，摇匀，制成混合对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，备用。

2.2.2 供试品溶液制备：取红参样品，粉碎，过4号筛，称取粉末约1.5g，精密称定，置50mL量瓶中，加50%的乙腈溶液，超声处理40min后，放冷至室温，加50%乙腈溶液定容，摇匀，过滤，取续滤液，经0.45μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验：精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，进行测定，结果供试品溶液色谱图中主峰与对照品溶液主峰一致，分离度良好，无杂质干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL、20mL、50mL，分别置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液定容至刻度，摇匀，取上述不同浓度的系列溶液进样测定，记录峰面积，以各成分的峰面积积分值为纵坐标(Y轴)，质量浓度为横坐标(X轴)绘制标准曲线，得到人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人参二醇线性回归方程。结果显示线性关系良好。见表1。

表1 各成分线性关系考察结果

2.3.3 精密度试验: 取混合对照品溶液，进样测定6次，记录峰面积，根据人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人参二醇峰面积的RSD判断该方法精密度。见表2。

2.3.4 稳定性试验: 取同一供试品溶液，分别在不同时间(0、2、4、6、8、16、24h)进行测定，记录峰面积，根据峰面积的RSD判断供试品溶液稳定性。见表2。

2.3.5 重复性试验: 精密称取同一样品6份，制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，根据峰面积的RSD判断该方法重复性[7]。见表2。

2.3.6 加样回收试验: 称取已知含量的样品约0.75g，6份，精密称定，分别置50mL量瓶中，分别加入混合对照品溶液5mL，制备供试品溶液进样测定，记录峰面积，计算回收率。见表2。

表2 各成分回收率、精密度、重复性、 稳定性测定结果

各成分的回收率、精密度、重复性、稳定性结果显示，精密度在0.65%～1.56%，表明仪器精密度良好，稳定性在1.40%～1.97% ，表明供试品溶液室温条件下稳定性良好，重复性在0.32%～2.58%，表明该方法重复性良好，各成分回收率在96.24%～102.10%，符合要求。

2.4 样品测定结果

按照本文建立的方法，测定5批红参样品，按外标法计算含量，结果红参样品中人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf平均含量分别为0.516mg/g、0.287mg/g、0.338mg/g、0.154mg/g、0.184mg/g、0.020mg/g，人参二醇平均含量为1.524mg/g。

3 讨论

红参是一种大宗药材，除简单加工销售外，还可以作为原料制备成中成药，在中成药的加工过程中，红参中的有效成分人参皂苷及人参二醇会受到酸碱度、温度等影响后发生转化，皂苷的转化程度和种类受加工工艺的影响会有很大差别，一些皂苷类物质可能发生结构转化形成次级皂苷，但含量过低，难以检测[8,9]。本研究采用高效液相色谱法，具有应用广泛、造价低等特点，将乙腈和水作为流动相，分离效果好，且起到了保护色谱柱的作用，解决了磷酸盐对色谱损耗大，清洗困难等问题，操作简便快捷，准确度高[10]。

本研究采用梯度洗脱程序，能够同时测定多种人参皂苷及人参二醇含量，提高了效率。本研究色谱条件优化过程中，以甲醇为空白对照，对甲醇及所有对照品进行全波长(190～400nm)扫描，结果显示人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf在203nm波长处有最大吸收，人参二醇在230nm波长处有最大吸收，故将该波长作为检测波长[11]。人参皂苷与人参二醇在Ulitimate XB-C18(2)色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)分离效果好，保留时间适中。考察乙腈-水和甲醇-水两种梯度洗脱系统，结果显示乙腈-水作为流动相分离度较好，经考察流速为0.30ml/min时分离效果较理想。采用外标法对6种人参皂苷及人参二醇含量进行计算，为提高结果精密度，应注意操作步骤的一致性，严格控制提取时间、酸碱度、温度、水解时间等因素，在样品吹干及转移过程中注意产品丢失[12,13]。

综上，高效液相色谱法检测红参中人参皂苷及人参二醇的含量效果较好，重复性、稳定性好，精密度高，且方便快捷，适用于人参皂苷及人参二醇的定量检测。