转录因子EB通过细胞自噬调节肿瘤进展的作用及机制

张梦婷，吕晓名，王岚枫，陈志平

（1. 赣南医学院2020级硕士研究生；2. 赣南医学院第一附属医院；3. 赣南医学院第一附属医院肾内科；4. 赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）

1 TFEB的分子生物学性质

转录因子EB（Transcription factor EB，TFEB）是小眼畸形转录因子家族（Microphthalmia transcription factor E，MiT-TFE）成员之一，该家族还包括：小眼相关转录因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF）、转录因子E3（Transcription factor E3，TFE3）和转录因子EC（Transcription factor EC，TFEC）。所有这些转录因子都具有高度相似的同源序列，由碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（Basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZIP）二聚序列、反激活区、DNA 结合域组成。所有的MiT-TFE 转录因子家族都含有与一个回文DNA 序列E-box结合的结构域，该DNA 序列位于其靶基因启动子附近［1］。TFEB的基因定位于Chr 6p21. 1 区域，可转录产生2 364 bp 长的mRNA，包括2 个非编码外显子和8 个编码外显子［2］。

TFEB 是溶酶体生物合成和自噬的主要调控因子，TFEB通过去磷酸化解除与14-3-3蛋白的结合作用，从而进入细胞核，转录下游靶基因后诱导自噬。自噬通常由大自噬（Macroautophagy，MA）、伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）和微自噬（Microautophagy，MIA）组成，自噬常被以下刺激激活：如代谢或环境应激、营养剥夺、氧化应激、缺氧和感染等［3］。自噬在肿瘤细胞中具有两种作用：一方面它可通过阻碍慢性组织损伤，促进肿瘤蛋白底物、错误折叠的蛋白以及受损细胞器的清除，从而抑制肿瘤发生［4］；另一方面它又可通过增强自噬介导的细胞内循环来加快肿瘤恶性进程［5］，也可通过增强肿瘤细胞自噬来增强肿瘤的恶性特征表达［6］。TFEB 介导的溶酶体到细胞核的信号转导通路由mTORC1、PKC、AKT、ERK2、MAP4K3/GLK、钙调磷酸酶等进行调控［7］。TFEB 在线粒体功能障碍疾病如代谢综合征、神经退行性疾病、糖尿病、肥胖等疾病中发挥着重要作用，在大部分肿瘤中，mTORC1对TFEB核定位的调节占主导地位［8］。

2 TFEB核定位的激活诱导自噬

2. 1 mTORC1 介导的TFEB 磷酸化在营养充足的正常细胞中，溶酶体腔内的氨基酸通过一种依赖于溶酶体v-ATPase的机制改变Rag的活化状态［9］，溶酶体表面活化状态的Rag GTPases（即GTP 结合的RagA/B 和GDP 结合的RagC/D）和mTORC1 复合体的Raptor 亚基相互结合，使mTORC1 被招募到溶酶体膜表面［10-11］，mTORC1 磷酸化TFEB 中的3 个特定的丝氨酸残基S122、S211、S142，导致TFEB与14-3-3蛋白相互作用并保留在细胞质中［12］。当细胞处于饥饿或溶酶体应激状态时，Rag GTPases、mTORC1失活并被溶酶体膜释放，TFEB 去磷酸化导致其与14-3-3 蛋白分离，从而使TFEB 进入细胞核内。TFEB 进入细胞核后，与溶酶体基因启动子区的CLEAR 元件结合，诱导下游的溶酶体基因表达，从而诱导溶酶体生物合成和自噬体-溶酶体融合［13-14］。作为TFEB 的上游调控因子，mTORC1 的调控机制有：⑴生长因子所诱导的Rheb 与GTP 的结合态，可以激活mTORC1，Rheb 是Ras 家族的一种小型GTPase；⑵可以被结节性硬化复合体（Tuberous sclerosis complex，TSC）所抑制［15］。此外，DI MALTA C等［16］研究表明，TFEB 不仅是mTORC1 的底物，在饥饿条件下，TFEB 的核定位与RagD 表达显著相关，RagD是TFEB 的直接转录靶点，TFEB 对RagD表达的转录调控影响了溶酶体对mTORC1 的招募。TFEB和mTORC1是一个反馈闭环的重要组成部分，mTORC1负调控TFEB，而TFEB反过来可通过RagC/D转录诱导正向调节mTORC1活性［17］。见图1。

2. 2 AKT 促进TFEB 磷酸化AKT 对TFEB 磷酸化的机制：⑴AKT通过磷酸化TSC2激活mTORC1促进TFEB 磷酸化；⑵AKT 直接磷酸化TFEB 的Ser467位点使其留在胞质内（图1）。TSC2的羧基末端结构域作为Rheb 的GTPase 的激活蛋白，可促进Rheb-GTP 向Rheb-GDP 转化。在与GTP 结合的形式中，Rheb 是mTORC1 的一个重要激活剂，因此，AKT 介导TSC2 磷酸化，可使Rheb-GDP 向Rheb-GTP 转化，从而激活mTORC1，AKT 通过调控TSC-RhebmTORC1 回路，将生长因子信号与控制细胞生长代谢变化的主要信号节点连接起来，mTORC1 的激活可促进TFEB 磷酸化，促进多种合成代谢过程，如蛋白质、脂质和核苷酸的合成，同时抑制自噬的分解代谢过程［18］。 mTORC1 的另一个上游调控因子ERK，其对TSC2/Rheb级联作用与AKT平行，可以抑制TSC2，通过Ras-ERK 通路整合生长因子的信号，激活mTORC1。PALMIERI M 等［19］研究发现，AKT可不依赖mTORC1 而通过直接对TFEB 的Ser467 位点的磷酸化来负向调控TFEB 活性。一种不依赖于mTOR 的自噬诱导剂海藻糖，通过抑制AKT 来促进TFEB的核转位，以增强自噬和细胞清除率。

图1 AKT、mTORC1调控TFEB磷酸化的通路

2. 3 溶酶体Ca2+促进TFEB 核易位在饥饿或过度消耗的情况下，溶酶体Ca2+通过黏脂蛋白1（Mucolipin 1，MCOLN1）迅速释放，形成毗邻溶酶体的钙微区，这种钙的局部积累诱导激活了钙调磷酸酶去磷酸化TFEB 的两个关键丝氨酸亚基S211、S142，使TFEB 核积聚并激活转录靶基因，诱导溶酶体的发生和自噬（图2）。MEDINA D L 等［20］基于TFEB 在饥饿期间胞浆-核内穿梭的细胞试验对磷酸酶siRNA 文库进行了高通量筛选，发现抑制蛋白磷酸酶3 催化亚基B（PPP3CB）可以抑制TFEB 核易位；此外，钙调磷酸酶的抑制剂环孢素A 以及FK506可使TFEB减少核易位。

图2 溶酶体Ca2+促进TFEB核易位

2. 4 MAP4K3/GLK 磷酸化TFEBMAP4K3 通过对TFEB 氨基酸残基Ser-3 磷酸化抑制TFEB 核转位（图3）。mTORC1 磷酸化S211 是TFEB 保留在细胞质内的关键机制，HSU C L 等［21］研究发现，MAP4K3对TFEB氨基酸残基Ser-3磷酸化发生在mTORC1对TFEB 丝氨酸211 磷酸化之前，抑制氨基酸消耗介导TFEB 核转位。 值得注意的是，MAP4K3 介导的TFEB 失活促进了mTOR 抑制的自噬通路，但TFEB失活不受mTOR信号的调控［22］。

图3 调节TFEB磷酸化的非经典通路

2. 5 PKCβ 磷酸化TFEBPKCβ 可以磷酸化TFEB 的S461 和/或S462、S466、S468，使其停留在胞质，以保证溶酶体的生物合成（图3）。FERRON M等［23］通过体外激酶检测PKCβ 磷酸化了TFEB 的一个含有其保守C 末端基序（氨基酸293～475）的片段，但未磷酸化更多的N 末端基序（氨基酸88～219）片段，体外激酶检验确定TFEB 的S461 和/或S462、S466、S468 被PKCβ 体外磷酸化，从而保证了溶酶体的生物合成。

2. 6 ERK2 磷酸化TFEBERK2 属于丝裂原活化蛋白激酶1 家族，可以磷酸化TFEB 的Ser142，导致TFEB 滞留胞质［24］。当细胞处于饥饿状态，ERK2 与TFEB解离，使TFEB进入核内定位，诱导自噬（图3）。

3 TFEB在肿瘤中的作用

3. 1 肾癌（Renal cell carcinoma，RCC）肾细胞癌的发生以及其恶性程度主要受TFEB 表达的影响，研究表明，mTOR 通路的紊乱，导致TFEB在肾细胞癌中过表达。在ARGANI P 等［25］的研究中，8 例RCCs 成年患者全部显示了高水平的TFEB扩增，并表现出了肿瘤更强的攻击性。GUPTA S 等［26］研究一系列侵袭性RCCs 病例，在这些病例中6p21. 1 区域的基因组扩增，该区域基因组包括了TFEB、VEGFA CC、D3、ABCC10、PTK7等基因，TFEB基因扩增的肾癌与典型的乳头状、透明细胞和嫌色细胞肾细胞癌相比治疗效果更差。mTOR 通路在许多人类肿瘤疾病中表达上调，是抑制肿瘤的潜在治疗靶点，在透明细胞肾细胞癌中发现了mTOR通路紊乱。2007 年的一项大型试验显示，与雷帕霉素类似的坦西莫司提高了转移性透明细胞RCC 患者生存率，更能证明mTOR通路紊乱可能与RCC的发病有关［27］。

3. 2 胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）PDAC 发病与大自噬有关，且处于不同阶段自噬作用不同。在KLEIN K等［28］研究中，TFEB在45 例PDAC 患者中显著表达。在PDAC 细胞基础状况下，TFEB有核转录，而在细胞缺乏营养状况下，TFEB 核积累更大，但在TFEB沉默后，自噬仍然持续存在，这表明可能存在旁路信号。在PERERA R M 等［6］研究中，胰腺导管腺癌的发病机制与大自噬有关，用雷帕霉素抑制剂Torin1或丝裂原活化蛋白激酶抑制剂处理后，PDAC细胞系显示出每个MiT/TFE 蛋白的组成性核易位，尽管PDAC 细胞显示完整的mTORC1 信号，但它依旧存在MiT/TFE 的核易位。核易位诱导的大自噬对PDAC 的影响在不同的阶段有所不同，在肿瘤起始时，自噬有助于维持基因组稳定性并阻碍肿瘤的启动；在晚期疾病中，自噬降解并回收细胞成分以满足快速生长的代谢需要［29］。

3. 3 多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）MM 中TFEB 核易位水平增加，主要通过mTOR 以及AKT 信号通路下降、ERK2 的抑制来调节。一定水平的自噬对MM 细胞的稳态起着重要的作用，研究人员通过应用FK866 抑制了烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）后，mTOR 以及AKT 信号通路下降，导致TFEB 核易位增加，从而增加了自噬程度。还可通过ERK2的抑制来使TFEB 核易位，上调自噬水平，所涉及的下游具体基因仍在探索中［30］。

3. 4 肺癌（Lung cancers，LC）肺癌中p53基因抑制以及p53基因影响mTOR 信号调控TFEB 核定位。ZHANG Z L 等［31］研究发现，抑癌基因p53的缺失或抑制促进TFEB 从细胞质向细胞核转移，从而增加TFEB 介导的肺癌细胞溶酶体和自噬体的生物发生。此外，p53的重新表达可降低涉及自噬-溶酶体途径（ALP）的TFEB靶向基因的表达水平，而敲除TFEB可消除p53对ALP基因表达的调控作用。并观察到p53未直接与TFEB相互作用，推测在其实验模型中p53可能通过影响mTOR 信号间接调控TFEB 核定位，故还需要对mTOR 信号通路中的因素做进一步研究，如raptor、Rag GTPases、mTOR本身是否被p53靶向［31］。

3. 5 结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）CRC 中TFEB 通过增强Beclin1转录介导细胞自噬，其与肿瘤的恶性程度有关；另推测TFEB 可能通过介导mTORC1下游效应来增加CRC的发生风险。ZENG C J等［32］分析了188 例CRC 患者的数据，以评估EIF3H、UTP23、SPSB2、TFEB和RPS21基因表达水平在肿瘤组织和正常组织中的差异，结果显示，除TFEB外，其余4 个基因在肿瘤组织中的表达水平均高于正常组织，而TFEB 在肿瘤组织中的表达水平显著低于正常组织。CRC 样本中TFEB的转录与CRC 的不可控进展、深黏膜浸润、淋巴转移、侵袭性等临床特征以及不良预后相关；在CRC 细胞系中敲除TFEB基因均可阻止细胞增殖。Beclin1的表达与TFEB呈正相关，TFEB沉默抑制了Beclin1的扩增，表明TFEB通过增强Beclin1转录介导细胞自噬，TFEB可能通过介导mTORC1 通路的下游效应，至少在一定程度上增加了CRC 风险［32］。TFEB 是自噬-溶酶体途径和能量代谢的主调控因子，自噬失调与癌症的发生和进展有关。

3. 6 乳腺癌（Breast cancer，BC）BC 不良预后可能与TFEB 异常表达有关，肿瘤微环境中的酸性条件可增加TFEB 的核易位。GIATROMANOLAKI A等［33］评估了100 例T1 期BC 样本中TFEB 和溶酶体标记物的表达水平，发现1/4 的病例TFEB转录水平高。TFEB 表达与LAMP-2A、CTSD、LC3A、缺氧诱导因子2-α（HIF2-α）的表达呈正相关，与孕酮受体的表达呈负相关。TFEB 和CTSD 的表达与不良预后有关，TFEB 异常表达被认为是一个独立的预后因素。此外，微环境胁迫对BC 细胞系TFEB 动力学的影响表明，酸性条件能够刺激TFEB 扩增及其核转位。BC 的特征是血管生成增加和HIF2-α 的高表达，两者均与术后不良预后有关［34］。

3. 7 其他肿瘤在黑色素瘤中，MiT/TFE基因上调触发了RagD介导的mTORC1诱导，导致细胞过度增殖和肿瘤生长。因此，这种转录调节机制使细胞适应营养供应，并支持癌症细胞的能量需求代谢［35］。据报道，MiT-TFE家族转录因子的异常调控在多种肿瘤发生中起重要作用［36］，特别是这些转录因子的核转位被证明可诱导不同靶基因的表达，这些靶基因是肿瘤发生发展机制中的重要一环［6］。

综上所述，TFEB 的表达与各类肿瘤疾病的发生发展机制有着密切的联系，与TFEB 表达相关的通路主要有mTORC1、AKT、ERK2 等。这些通路通过调控TFEB 的表达，在癌症的预后、分期、分级以及治疗等方面发挥作用（图4）。

图4 TFEB在肿瘤中的作用

4 TFEB作为药物靶点在临床中的应用

4. 1 姜黄素激活TFEB 的转录姜黄素是从中草药中提取的疏水多酚，ZHANG J B等［36］研究发现，姜黄素治疗可以提高人结肠癌HCT116 细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的自噬通量，可以抑制雷帕霉素靶蛋白表达，还可以直接与TFEB结合，增加TFEB的转录活性。 进一步通过用姜黄素处理HCT116 细胞，发现姜黄素处理并没有增加TFEB 蛋白水平，经过免疫荧光染色，发现TFEB 进入了细胞核，且TFEB 与14-3-3 蛋白相互作用显著降低，表明TFEB 磷酸化水平降低［36］。SONG J X 等［37］研究认为，合成的姜黄素衍生物C1 是一种新的不依赖于mTOR 的TFEB 激活剂。化合物C1 在N 端特异性结合TFEB，促进TFEB 核转位而不抑制mTOR 活性。通过激活TFEB，化合物C1 增强了体外和体内的自噬和溶酶体生物合成［37］。

4. 2 疏水性弱碱化疗药物对TFEB 的去磷酸化作用疏水性弱碱化疗药物包括西拉敏、拓替康、舒尼替尼和阿霉素等，这些化疗药物通过阳离子诱捕在溶酶体中高度积聚，由于疏水性弱碱性化疗药物可以诱导溶酶体碱化，而碱化又可以损伤溶酶体活性，溶酶体感知自身损伤或应激，刺激溶酶体Ca2+离子的释放和钙调磷酸酶激活从而诱导TFEB 去磷酸化和核易位，诱发溶酶体生物发生和胞吐作用［38-39］。

4. 3 增强阿霉素抗肿瘤效果自然生成的双联苯类化合物（Marchantin M，Mar-M）抑制了在化疗耐药细胞中升高的衰老相关的分泌表型（Senescenceassociated secretory phenotype，SASP）成分，此成分被认为促进细胞耐药性。Mar-M 对TFEB 和核因子κB（NF-κB）的失活是其抑制SASP组分的重要原因，Mar-M 对SASP 的抑制作用在与阿霉素的联合治疗中发挥协同作用，降低毒性，提高抗肿瘤疗效［40］。

5 小 结

TFEB 是自噬的主要转录调控因子，通过对自噬的调节来维持细胞稳态，从而广泛参与各种生理病理过程。目前对多种调节TFEB 的核定位通路进行了研究，但其下游机制及靶基因尚不清楚还需进一步探索。TFEB在各种肿瘤疾病中都存在表达，其对肿瘤的发生发展有不同的作用，针对其在肿瘤中的表达机制，有调节其上游的信号通路的治疗药物，也有直接与TFEB 结合调控的药物。TFEB作为肿瘤治疗的潜在靶点，其研究在肿瘤治疗发展中具有很好的前景。