藏红花提取液对兔慢性高眼压视网膜神经节细胞损伤的保护作用研究

王双梅，常花蕾，冯 燕，于敬妮

(西安市人民医院 西安市第四医院，陕西 西安710004)

青光眼是以视神经萎缩和视野缺损为特征的致盲性眼病。虽然眼压升高是青光眼的主要危险因素，但也有部分眼压正常、视神经损伤仍在进展的青光眼病例。这些病例的致病因素可能与眼部微循环改变、自由基损伤、神经营养因子缺乏及节细胞凋亡等有关[1]。文献[2-3]报道藏红花可以改善微循环和清除自由基，具有保护神经、保护心肌、记忆增强等药理作用，在临床上已被用于心脏缺血损伤的研究；研究发现藏红花可通过抗凋亡、抗水肿对大鼠损伤神经起到保护作用[4-5]。我们曾观察到藏红花素对缺血再灌注视网膜神经损伤具有保护作用,为了进一步了解藏红花对高眼压视神经损伤的作用机制,本研究观察了藏红花对慢性高眼压模型动物视神经和视网膜节细胞的影响，为其临床应用提供进一步的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 地塞米松注射液(天津药业集团)，卡波姆2940(上海申兴制药厂),配成3 g/L复方卡波姆溶液，藏红花(空军军医大学口腔医院药剂科)，速眠新注射液(农牧大学军事兽医研究所)，其他试剂盒(德国罗氏公司)。

1.2 藏红花提取液的配制 藏红花150 g,加蒸馏水煮沸腾30 min后，过滤两次,滤液减压浓缩后,加3倍量950 ml/L乙醇，沉淀24 h,再过滤,减压蒸馏回收乙醇后,稀释为100 ml装瓶,灭菌30 min，用时再稀释成50 g/L溶液[6]。

1.3 实验动物 健康新西兰成年白兔(空军军医大学实验动物中心)，12～16月龄,体重2.5～3 kg。裂隙灯、眼底镜检查，排除眼部异常的动物,滴5 g/L丁卡因眼液表面麻醉，Schiotz眼压计测眼压，连续3 d,1次/d，测后滴左氧氟沙星滴眼液。选取眼压低于17 mmHg[5]的动物20只用于实验。

1.4 慢性高眼压模型的建立及动物分组 模型制成后分成高眼压组、治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组，每组5只(10只眼)，另5只兔作为对照组。白兔以速眠新0.1 ml/kg肌注麻醉，1 ml注射器吸入0.2 ml复方卡波姆溶液，从角膜缘刺入前房、留针，留针处对侧角膜缘，助手用1 ml注射器刺入前房，助手缓慢抽出房水约0.2 ml，术者向前房注入约0.2 ml复方卡波姆溶液，拔针棉签按压，滴左氧氟沙星眼水，每天测眼压，共28 d，眼压22 mmHg以上，提示慢性高眼压模型成功[7]。对照组动物仅作前房穿刺。

1.5 药物注射 模型成功后第2天开始给药。治疗Ⅰ、Ⅱ组耳缘静脉分别注射藏红花提取液20、80 mg/kg(分别为浓度50 g/L的藏红花提取液1、4 ml)，1次/d，连续28 d；高眼压组和对照组注射0.9%氯化钠溶液2 ml。

1.6 视神经标本的制备 治疗4周后，各组动物在速眠新注射液深麻下，1000 ml 浓度为40 ml/L多聚甲醛液经心脏灌流固定后，摘出球后3～5 mm段视神经，以含25 ml/L戊二醛的磷酸盐液固定1 h，以10 ml/L锇酸后固定，电镜梯度乙醇脱水后，Epon812做包埋，切1 μm厚半薄切片(视神经的近端切横切面)，甲苯胺蓝染色，光镜定位，再切成50 nm厚的超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后电镜观察。在透射电镜6000倍下，记数各个标本每个视野的视神经轴突数量，以视神经为基准分别向两侧，每个标本取10个方位，每个方位4个视野，最后求出平均值分析。

1.7 视网膜切片的制备 上述动物取出视神经后，沿相同矢状面剪开眼球，剪出带视神经的视网膜组织，剪去角膜，在40 ml/L多聚甲醛液中后固定20 min，200 ml/L蔗糖溶液浸泡至完全下沉。将标本用Tissu-Tek包埋，用恒冷箱冰冻切片机切片，片厚12 μm，裱于多聚赖氨酸预处理的载片上，置于-20 ℃以备TUNEL、HE染色及免疫组化用。

1.8 TUNEL染色 视网膜切片，在室温下晾干后，按以下步骤染色：0.01 mol/L PBS洗5 min； 10 μg/ml蛋白酶K液孵育5 min；0.01 mol/L PBS洗5 min；玻片加TDT反应复合物，37 ℃孵育2 h；SSC浸洗玻片15 min，PBS洗两次，3 ml/L H2O2洗3 min，HRP孵育30 min，PBS洗两次，DAB呈色、水洗、脱水、封片，镜下观察。凋亡细胞以Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行分析。

1.9 Caspase 3免疫组织化学染色 Caspase 3免疫组化试剂盒进行标记染色，具体步骤如下：PBS(pH7.2)缓冲液冲洗，浸入 0.01 mmol/L 柠檬酸中高压热修复，正常血清PBS，室温下孵育20 min，除去血清；滴加稀释的一抗，滴加生物素标记二抗(1%BSA-PBS 稀释)，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，脱水、显色剂显色。

2 结 果

2.1 视网膜神经节细胞层形态 HE染色显示：对照组视网膜节细胞呈单层排列整齐(图中最上面一层，箭头处)，数量丰富 (图1A) 。高眼压组视网膜变薄，节细胞层数目极少，残存的节细胞出现空泡化改变(图1B) 。治疗Ⅰ组视网膜各层结构层次可见，节细胞层排列相对整齐，数目较高眼压组明显增多 (图1C) 。治疗Ⅱ组视网膜节细胞层结构及数量接近对照组 (图1D) 。

A：对照组；B：高眼压组；C：治疗Ⅰ组；D：治疗Ⅱ组

2.2 电镜下节细胞轴突数量及超微结构 6000倍下高眼压组视神经内节细胞轴突数量较其他三组明显减少，两治疗组神经轴突数量显著增加，而治疗Ⅱ组接近于对照组，经单因素方差分析,显示各组之间差异有统计学意义(均P<0.05)，SNK法进行两两比较，高眼压组与治疗Ⅰ组之间存在统计学差异(均P<0.05)，对照组、治疗Ⅱ组与高眼压组、治疗Ⅰ组之间比较均存在统计学意义(均P<0.05)，见表1。对神经轴突的超微结构观察，对照组：视神经轴突结构完整，板层清晰；高眼压组：视神经轴突髓鞘结构破坏、紊乱，可见节段性脱髓鞘、轴索变性、轴膜脱离等；治疗Ⅰ组：视神经轴突髓鞘较薄，轴膜仍有脱离。治疗Ⅱ组：视神经轴突髓鞘稍薄，轴膜完整，结构形态接近正常。

表1 电镜下视神经轴突计数比较(个)

2.3 各组神经节细胞凋亡比较 TUNEL染色显示：对照组节细胞层染色浅淡，鲜有深染的TUNEL阳性细胞(箭头所指处)，凋亡细胞数为(1.8±0.23)个(图2A)。高眼压组节细胞层有大量浓染的TUNEL阳性细胞，凋亡细胞数为(26.7±4.51)个(图2B)。治疗Ⅰ组节细胞层深染的TUNEL阳性细胞数量较高眼压组明显为少，凋亡细胞数为(15.3±2.52)个(图2C)。治疗Ⅱ组节细胞层染色淡，仅见个别深染的阳性细胞，凋亡细胞数为(3.9±1.68)个(图2D)。各组间经统计学分析,显示各组间差异有统计学意义(均P<0.05)。

A：对照组；B：高眼压组；C：治疗Ⅰ组；D：治疗Ⅱ组

2.4 各组免疫组化 Caspase 3表达情况比较 对照组中Caspase 3表达最弱，节细胞层仅见散在棕黄色的阳性细胞(图3A箭头所指处)。高眼压组表达最强，节细胞层可见大量棕黄色阳性细胞，视网膜全层都有表达，内核层也见浓染的棕黄色阳性细胞(图3B)。治疗Ⅰ组视网膜各层可见棕黄色阳性细胞，节细胞层棕黄色阳性细胞数量较高眼压组明显减少(图3C)。治疗Ⅱ组视网膜各层有少量棕黄色阳性细胞，节细胞层散在棕黄色阳性细胞，数量接近对照组(图3D)。

A：对照组；B：高眼压组；C：治疗Ⅰ组；D：治疗Ⅱ组

3 讨 论

青光眼为全球第一位不可逆性致盲性眼病，神经节细胞损伤是青光眼损伤核心问题，而视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells，RGCs)凋亡是其病理基础[8]。表现为随着视网膜组织缺血缺氧时间的延长及机械压力的持续存在，RGCs缺血缺氧而受损，其轴突构成的视神经也损伤、变性；或者处于胶原纤维中的血管受压变形，造成缺血缺氧，神经通路受阻，导致视神经轴突结构改变，节细胞坏死，并产生大量的氧自由基，进一步加重RGCs凋亡程度[9]。有研究表明，氧自由基造成视网膜组织核酸断裂，脂质过氧化，激活Caspase，致使神经节细胞凋亡[10-11]。现代研究表明，Caspase家族是细胞凋亡的必经之路，Caspase 3是多条凋亡通路的汇聚点，通过活化Caspase 3，最终启动细胞凋亡程序[12]。因此，阻断Caspase 3的活化是中断细胞凋亡发生的重要途径。

传统中药藏红花具有活血化瘀功效。已有研究表明，藏红花有改善视网膜缺血状态、抗氧化和抑制凋亡等作用[13-14]，其抗凋亡特性已被许多研究证实[15-16]；有研究发现藏红花素可通过抗凋亡、抗氧化作用在高眼压状态下保护视网膜视神经[17-18]；同时研究[19-20]表明，藏红花素具有抑制氧自由基、改善线粒体功能，从而抑制RGCs凋亡。本研究从视网膜神经节细胞层形态学入手，观察到高眼压组RGCs数量显著减少，残存节细胞空泡化，藏红花治疗Ⅰ组节细胞层排列相对整齐，治疗Ⅱ组节细胞结构及节细胞数量接近对照组；对神经节细胞轴突电镜观察，见高眼压组神经轴突形态损伤严重，数量显著性减少；藏红花治疗Ⅰ组神经轴突髓鞘薄，数量增加；治疗Ⅱ组视神经轴突形态、数量基本接近对照组，说明藏红花对RGCs及其神经轴突有保护作用，且高剂量组效果更佳，这与Yang等[16]研究观点不谋而合；进一步TUNEL染色，检测到高眼压组节细胞凋亡严重，凋亡细胞数为(26.7±4.51)个，与正常对照组比较有统计学差异，藏红花治疗Ⅰ组节细胞凋亡细胞数为(15.3±2.52)个，治疗Ⅱ组仅见个别深染的阳性细胞，凋亡细胞数为(3.9±1.68)个，与高眼压组比较差异有统计学意义，说明藏红花可减缓RGCs凋亡，且高剂量组作用更强；最后从凋亡发生重要环节、Caspase 3做检测，结果见高眼压组节细胞层大量阳性细胞，证实大量Caspase 3蛋白表达，藏红花治疗Ⅰ组节细胞层棕黄色阳性细胞数量明显减少，治疗Ⅱ组少量棕黄色阳性细胞，节细胞层散在棕黄色阳性细胞，数量接近对照组，说明藏红花可减少Caspase 3蛋白表达，且高剂量组阻断效果更明显。

综上所述，本实验从RGCs形态学、RGCs轴突超微结构及数量、TUNEL染色节细胞凋亡及Caspase 3蛋白表达等方面，说明藏红花对RGCs及其轴突损伤有改善作用，藏红花可阻断Caspase 3蛋白表达，抑制RGCs凋亡，减轻神经节细胞轴突损伤，最终起到保护神经节细胞损伤的作用。然而，慢性高眼压视神经RGCs损伤可能还存在其他因素作用的结果，而藏红花对其保护的更深层面作用有待进一步研究。