不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸品质特性和蛋白二级结构的影响

洪金玲，何慧琪，翁武银，姜泽东，2，3，4，倪 辉，2，3，4，郑明静，2，3，4*

（1 集美大学海洋食品与生物工程学院 福建厦门 361021 2 福建省食品微生物与酶工程重点实验室 福建厦门 361021 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 大连工业大学 辽宁大连 116034 4 厦门市食品与生物工程技术研究中心 福建厦门 361021）

柚子为芸香科植物常绿果树柚树的成熟果实，主要分布在热带和亚热带地区，我国柚子资源丰富，年产量位居世界前列，福建、广东、广西等地区为柚子的主产区，是当地特色的经济作物之一[1-3]。柚子表皮呈浅黄色或橙色，约占整个柚果实质量的40%～50%[3-4]。在生产果汁、果酱、水果罐头、蜜饯等的过程中会产生大量的柚子皮、渣副产物，大多作为垃圾废弃，造成资源浪费和环境污染等问题[2-3]。近年来对柚子皮的综合利用受到关注。柚子皮中含有61.79%±0.87%（干基） 总膳食纤维[5]、10.41%多糖[6]、1.06%香精油[7]以及多种生理活性成分。目前对其的综合利用主要作为上述活性成分的提取原料，而对于柚子皮全粉的利用研究相对较少。张璐[8]将柚子皮添加到肉酱中，制得的柚子皮肉酱柚香浓郁、颜色鲜亮、咀嚼感强，具有丰富的营养和保健作用。本文为提高柚子皮副产物的高值化利用，将柚子皮全粉应用于开发鱼糜制品。

我国水产品资源丰富，鱼糜是市场上主要的水产加工制品。2019年，我国鱼糜制品产量为139.40 万t，占我国水产品总量为2.15%；其中，福建鱼糜制品产量居全国榜首，约为431 274 t，占全国鱼糜制品总产量的30.94%[9]。鱼丸是我国常见的传统鱼糜制品之一，属于高蛋白质食品，可通过添加膳食纤维提高其膳食结构的合理性。例如：孟爽爽[10]研究报道，麸皮膳食纤维应用于鱼糜凝胶时，需筛选合适的粒径以减小其对鱼糜凝胶强度和质构的影响。目前，对膳食纤维改善鱼糜凝胶的研究集中在可溶性膳食纤维含量高的原料上，而针对不溶性膳食纤维高的原料如何影响鱼糜制品的品质及其作用机制尚不明确。因此，本文以不溶性膳食纤维为主的柚子皮为研究对象，结合粒径筛分和气流粉碎处理技术制备不同粒径的柚子皮全粉，研究不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸品质特性和蛋白二级结构的影响。本研究结果不仅可为高膳食纤维鱼丸的开发提供理论依据，还可提高柚子加工过程中柚子皮副产物的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻白鲢鱼糜，福建省安井食品股份有限公司；柚子皮，福建柚之乡食品有限公司；木薯淀粉（食品级），福建省双龙食品有限责任公司；复合磷酸盐（质量比为1∶1∶1 的六偏磷酸钠、焦磷酸钠和三聚磷酸钠的混合物均为食品级），湖北兴发化工集团股份有限公司；盐、TG 酶、膳食纤维AQ、膳食纤维7000F 均为食品级，市售；溴化钾光谱级，上海阿拉丁有限公司。

1.2 仪器与设备

斩样机，英博机械制造有限公司；LHL50 气流粉碎机，潍坊正远粉体工程设备有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛西城新瑞仪器厂；C21-RH2153 电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司；HZT-A500 电子天平，华志（福建）电子科技有限公司；TA.TOUCH 质构仪，上海保圣实业发展有限公司；Centrifuge5810R 离心机，艾本德中国有限公司；ADCI-WSI 白度仪，北京辰泰克仪器技术有限公司；Nicolet iS50 傅里叶红外光谱分析仪，赛默飞世尔科技公司；Free Zone 6 plus 真空冷冻干燥机，美国Labconco 公司；SC-412 冰箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚子皮全粉的制备 新鲜柚皮块采用水提和醇提法（柚皮粉与60%乙醇溶液按质量浓度0.1 g/mL 混合后，于50 ℃浸提3～4 次）脱苦后，烘干、粗粉碎得到柚子皮粗粉，将部分柚子皮粗粉利用100 目筛网筛选<150 μm 柚子皮全粉；另外一部分柚子皮粗粉结合气流粉碎机超微粉碎处理，通过调节工作频率为50，75，100 Hz 分别获得90%粒径范围小于20，28，53 μm 的柚子皮全粉。

1.3.2 鱼丸的制备 鱼丸的配方：冷冻白鲢鱼糜700 g，水180 g，木薯淀粉100 g，盐20 g，柚子皮全粉或市售膳食纤维10 g，复合磷酸盐2 g，TG 酶1 g。

将冷冻的白鲢鱼糜放于4 ℃温度下，解冻10 h 左右，获得半解冻鱼糜。

将不同粒径的柚子皮全粉或市售膳食纤维溶于小部分水中，充分搅拌后，溶胀1～2 h 左右；剩下的水放于冰块中，使其成冰水备用。

将半解冻鱼糜切成小块，将小块鱼糜置于斩样机中低速空斩3～4 min 成糊状；先将30%食用盐分2 次加入，中速斩拌7 min，至浆料黏稠、细腻；加入70%食用盐中速擂溃2 min，至浆料更加细腻、有光泽；加入溶胀后的柚子皮全粉或膳食纤维，并加入少量冰水，中速斩拌2 min，使柚子皮全粉或膳食纤维与浆料混合均匀（以不添加柚子皮全粉和膳食纤维的鱼丸做空白组）；最后依次加入木薯淀粉、混合磷酸盐、剩余冰水和TG 酶，高速斩拌至浆料混合均匀；将混合均匀的浆料挤成小圆球，先在45 ℃的水温下低温定型30 min，然后立即在90 ℃的水温下高温定型5 min，定型好的鱼丸迅速加冰冷却10 min 左右。冷却后的鱼丸一部分放于4 ℃冰箱中贮藏24 h 后测定各项指标，一部分放于-18 ℃以下的冻库中贮藏7 d 后测定各项指标。

1.3.3 鱼丸持水力测定 参考梁雯雯等[11]方法，将鱼丸切成薄片，称取（2.00±0.20）g 样品（M1，g），用双层滤纸包裹，置于50 mL 离心管中，4 ℃，8 000 r/min 离心10 min，取出样品称其质量（M2，g），按式（1）计算持水力：

1.3.4 鱼丸质构特性测定 将鱼丸切成约为2 cm×2 cm×2 cm 的方块，采用TA.TOUCH 质构仪，探头型号为P36R，模式为压缩，设定测试前速度2 mm/s，测试速度1 mm/s，测试后速度2 mm/s，触发力5 g，形变50%。质构参数：硬度、弹性、咀嚼性。

1.3.5 鱼丸凝胶强度测定 将鱼丸切成约为2 cm×2 cm×2 cm 的方块，采用型号为TA.TOUCH 质构仪，探头型号为P/5S，模式设定为压缩模式，设定测试前速度2 mm/s，测试速度1 mm/s，测试后速度2 mm/s，触发力5 g，穿刺深度10 mm。

1.3.6 鱼丸白度测定 将鱼丸切成约为2 cm×2 cm×2 cm 的方块，采用白度仪测定，仪器先用调黑，再用标准白板校准，测定其白度值。

1.3.7 傅里叶红外光谱分析 参照Guan 等[12]方法，将鱼丸切成薄片后冷冻干燥，粉碎成细粉，与溴化钾粉末按1∶100 混合，研磨均匀并压片，使用红外光谱仪，在4 000～400 cm-1范围内扫描样品。采用PeakFit 软件针对1 700～1 600 cm-1范围进行Gaussian 拟合分析鱼丸蛋白二级结构[13]。

1.3.8 数据分析 傅里叶红外光谱试验平行次数为3 次，其余试验平行次数为5 次，采用Origin 8.0 软件作图，应用SPSS Statistics 26 软件和Excel 软件对试验数据进行分析，采用Duncan 多重比较进行各数据之间的显著性对比，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸持水力的影响

鱼糜的持水力是指当鱼肉受外力（如加压、解冻和腌制）影响时，保持其水分的能力，也称为鱼糜的持水性或保水性，是评价鱼糜及其制品品质的重要参数[14-15]。不同粒径的柚子皮全粉对冷藏鱼丸的持水力的影响如图1a 所示，结果表明，与空白组相比，添加1%柚子皮全粉或市售膳食纤维均会导致冷藏鱼丸持水力降低（P<0.05）。这可能是由柚子皮全粉与膳食纤维的添加引起鱼糜凝胶结构的破坏，导致凝胶截留水分能力降低，与涂晓琴[16]研究豆渣对白鲢鱼糜持水力影响的结果相一致。另外，添加市售膳食纤维AQ 的鱼丸持水力低于添加市售膳食纤维7000F 的鱼丸持水力，说明不同品种膳食纤维对鱼丸持水力的影响有显著差别。与此类似，添加1.5%甘蔗不溶性膳食纤维的复合肌原纤维蛋白凝胶的持水力显著高于添加1.5%魔芋葡甘露聚糖的蛋白凝胶的持水力（P<0.05）[17]。对比不同粒径的柚子皮全粉对冷藏鱼丸持水力的影响，发现粒径变化对其持水性影响差异性不显著（P ≥0.05）。这与前人研究相一致，当重组鱼糜的水分含量一定时，外源添加物的粒径对冷藏鱼糜凝胶持水性并无显著性影响[16，18]。

冻藏7 d 后，不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸持水力的影响如图1b 所示。结果表明，与冷藏鱼丸相比，冻藏后对应试验组的持水力均显著降低（P<0.05）。这说明贮藏温度变化对鱼丸持水力有较大影响，可能由于鱼糜在冷冻过程中，水分子的运动、冰晶的形成与生长，加速了鱼糜蛋白质的聚集和变性，破坏了蛋白凝胶结构对水分的截留能力，从而导致冻藏鱼丸的持水力低于冷藏鱼丸[19]。添加市售膳食纤维AQ 和7000F 鱼丸的持水力与空白组相当，无显著性差异（P ≥0.05）。添加粒径小于150 μm 柚子皮全粉时，鱼丸的持水力显著提高至83.74%，较空白组增加了9.22%（P <0.05）；然而，随着柚子皮全粉粒径的降低，鱼丸持水力逐渐减少，当其粒径低于53 μm 时，所制备鱼丸的持水力甚至低于空白组（P<0.05）。这可能与超微粉碎处理破坏了不可溶性膳食纤维的结构完整性，并降低其与水结合的能力有关[20-21]，削弱了柚子皮全粉将水固定在鱼丸凝胶蛋白网状结构内的能力。

图1 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸持水力的影响Fig.1 Effects of pomelo peel powder with different particle sizes on the water holding capacity of fish balls

2.2 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸凝胶强度的影响

凝胶强度是表征凝胶类食品物理结构的刚性因子，是评价鱼糜制品的组织结构、持水性和贮藏稳定性等品质特性的重要指标[21]。不同粒径的柚子皮全粉对冷藏24 h 鱼丸凝胶强度的影响如图2a 所示，与空白组相比，小于20 μm 柚子皮全粉和市售膳食纤维AQ 对冷藏鱼丸的凝胶强度影响较小，无显著性差异（P≥0.05）；而添加小于28，53，150 μm 的柚子皮全粉和市售膳食纤维7000F显著降低鱼丸的凝胶强度（P<0.05）。添加不同粒径的柚子皮全粉对冻藏7 d 鱼丸凝胶强度的影响如图2b 所示，与空白组相比，<53 μm 柚子皮全粉和市售膳食纤维AQ 显著降低鱼丸的凝胶强度（P<0.05），其它粒径范围的柚子皮全粉和市售膳食纤维7000F 对鱼丸凝胶强度的影响不显著（P ≥0.05）。结果说明，柚子皮全粉和膳食纤维对鱼丸凝胶强度受颗粒粒径、膳食纤维品种以及贮藏条件的影响。孟爽爽[10]研究发现添加麸皮不溶性膳食纤维，可显著降低鱼糜凝胶的凝胶强度，其对鱼糜凝胶的破坏作用与穿插阻断蛋白交联有关，而且破断力（凝胶强度）随粒径的降低呈先降低后增大的趋势。由此推断，柚子皮全粉使鱼丸凝胶强度下降可能与其阻断蛋白交联有关。研究表明鱼丸的持水力与凝胶强度密切相关，一般认为鱼丸的持水力越高，说明蛋白质之间的网络结构越紧密，保持水分的能力越强，相应的凝胶强度也越高[24]。然而，本研究显示，与空白组相比，添加粒径小于150 μm 柚子皮全粉时，鱼丸的持水力显著增加，然而其凝胶强度并未有显著性变化。由此推断，较大颗粒柚子皮全粉对鱼丸持水力的影响更可能与其物料的结合水能力变化有关，而不取决于复合体系凝胶特性。

图2 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸凝胶强度的影响Fig.2 Effects of pomelo peel powder with different particle sizes on the gel strength of fish balls

2.3 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸质构特性的影响

不同粒径的柚子皮全粉对冷藏24 h 后鱼丸质构特性的影响如表1所示。与空白组相比，添加柚子皮全粉与膳食纤维一样，冷藏鱼丸的硬度和咀嚼性均显著降低（P<0.05），这可能与上述提及柚子皮全粉与膳食纤维破坏鱼糜蛋白凝胶结构有关，导致口感变软。相较于其它粒径范围的柚子皮全粉，添加小于28，53 μm 的柚子皮全粉的冷藏鱼丸的硬度较小（P<0.05）。然而不同粒径柚子皮全粉对于鱼丸的咀嚼性的影响差异不明显 （P≥0.05）。另外，除了市售膳食纤维7000F 显著提高（P<0.05）冷藏鱼丸的弹性外，不同粒径柚子皮全粉和市售膳食纤维AQ 对冷藏24 h 鱼丸的弹性影响差异性不显著（P≥0.05）。

冻藏7 d 后，添加不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸质构特性的影响如表1所示。相比于冷藏组鱼丸，冻融后所有试验组鱼丸的硬度和咀嚼性均显著增加（P<0.05），这主要由于冻藏过程中鱼丸中的大部分液态水被转化为固态冰，冰晶的形成和生长会破坏鱼丸的凝胶结构，导致鱼丸的口感、质地整体下降[25]。添加柚子皮全粉和市售膳食纤维时，冻藏鱼丸的硬度和咀嚼性明显低于空白组，其弹性与空白组相当。

表1 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸质构特性的影响Table 1 Effects of pomelo peel powder with different particle sizes on textural properties of fish balls

2.4 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸白度的影响

白度也是衡量鱼糜制品品质的一个重要指标。不同粒径的柚子皮全粉对冷藏鱼丸白度的影响结果如图3a 所示，相较于空白组，冷藏鱼丸中添加<150 μm 的柚子皮全粉后，其白度显著降低（P<0.05）；而随着柚子皮全粉粒径减小，柚子皮全粉对鱼丸的白度影响不显著（P ≥0.05）。添加市售膳食纤维时，鱼丸的白度显著高于空白组和添加柚子皮全粉鱼丸的白度（P<0.05）。图3b 显示了冻藏7 d 后，添加不同粒径的柚子皮全粉对冻藏鱼丸白度的影响。冻藏7 d 后，与冷藏鱼丸相比，所有试验组的白度值都显著下降（P<0.05），这可能与鱼丸的持水力减弱有关，冰晶变化破坏了鱼丸蛋白网状结构，从而削弱了鱼丸对水分的截留能力，解冻后水分流失而使鱼丸表面潮湿，对光线的反射能力降低，从而影响鱼丸的白度值[16]。对比不同粒径的柚子皮全粉对冻藏鱼丸白度的影响与冷藏条件下相似，除了小于150 μm 的柚子皮全粉，小于53 μm 的柚子皮全粉也导致鱼丸白度下降（P<0.05）。柚子皮全粉使鱼丸白度下降以及膳食纤维使鱼丸白度提高，可能与市售膳食纤维颗粒呈白色、柚子皮全粉呈淡黄色的色泽差异有关。与此类似，Zhang 等[26]研究发现在鱼糜香肠中添加蜂蜡油后，由于蜂蜡的黄色，鱼糜香肠的白度显著降低。Zhang 等[27]发现在鱼糜中添加酵母β-葡聚糖时，鱼糜的白度随酵母β-葡聚糖添加量的增加而降低。而随着粒径的降低，超微粉碎处理可能引起柚子皮全粉的色素损失，因而对鱼丸色泽的影响减弱[28]。

图3 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸白度的影响Fig.3 Effects of pomelo peel powder with different particle sizes on whiteness of fish balls

2.5 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白二级结构的影响

目前，市场上的鱼糜制品多以冷冻方式运输、销售以及贮藏，冷藏鱼糜制品则常见于手工作坊鲜销市场。对比冷藏和冻藏鱼丸凝胶强度，发现不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸凝胶强度的影响规律迥然不同。例如，添加小于150 μm 的柚子皮全粉导致冷藏鱼丸的持水力明显下降，而却能显著提高冻藏鱼丸的持水力；小于28 μm 的柚子皮全粉显著降低冷藏鱼丸的凝胶强度，而对冻藏鱼丸的凝胶强度的影响较小，与空白组相当。因此，在研究柚子皮全粉在鱼丸中的应用时，还应考虑贮藏条件的差异，针对不同贮藏条件筛选合适柚子皮全粉的粒径。冷藏时，不同粒径的柚子皮全粉的添加引起鱼丸的持水力、凝胶强度、硬度和咀嚼性降低；冻藏时，小于150 μm 的柚子皮全粉能够显著提高冻藏鱼丸的持水力，而凝胶强度和弹性与空白组相当。由此可见，柚子皮全粉更适用于冻藏鱼丸的生产。对此，本文进一步采用FTIR 测定柚子皮全粉对鱼丸蛋白分子结构变化的影响，以期解析不同粒径的柚子皮全粉影响鱼丸加工品质（持水性、凝胶强度、硬度等质构特性）的分子机制。

FTIR 是检测蛋白质二级结构的常用方法之一，具有操作方便，检测速度快，对样品损坏小的特点[29]。用FTIR 对冻藏7 d 后的鱼丸进行分析，不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白二级结构的影响如图4所示。空白组鱼丸在3 299 cm-1和2 927 cm-1附近出现吸收峰，分别对应的是酰胺A 和酰胺B 区[12]。添加柚子皮全粉和市售膳食纤维主要影响鱼糜酰胺A 区的特征峰波数变化，颗粒小于53 μm 和150 μm 的柚子皮全粉和市售膳食纤维导致酰胺A 区的特征峰波数变高，表明体系中NH 伸缩振动增强。波谱带1 700～1 600，1 600～1 500，1 330～1 220 cm-1分别为蛋白结构的酰胺带Ⅰ和C＝O 振动、酰胺带Ⅱ和N-H 弯曲、酰胺带Ⅲ和C-N、N-H 拉伸[30-31]。与空白组相比，酰胺带Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在1 657，1 547 cm-1以及1 248 cm-1的特征峰，添加柚子皮全粉和市售膳食纤维的吸收峰波数较低，尤其是市售膳食纤维7000F；另外，不同粒径的柚子皮全粉之间酰胺带Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ特征峰波数差异不明显。表明较大颗粒柚子皮全粉和膳食纤维的添加能够影响蛋白质的交联作用，导致复合体系酰胺带官能团的振动变化差异。

图4 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白红外光谱的影响Fig.4 Effect of different particle sizes of pomelo peel powder on the FT-IR spectra of fish balls protein

蛋白二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲4 种主要形式，对应红外光谱的波数范围分别为1 650～1 660，1 600～1 640，1 660～1 700，1 640～1 650 cm-1。基于Gaussian 拟合1 700～1 600 cm-1范围的蛋白二级结构比例，不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白二级结构比例的影响如表2所示。结果表明，与空白组对比，添加不同粒径的柚子皮全粉和市售膳食纤维均对α-螺旋和无规则卷曲结构比例的影响无显著性差异（P≥0.05）。添加<150 μm 柚子皮全粉和市售膳食纤维AQ、7000F 均显著提高鱼丸蛋白β-折叠的比例，且市售膳食纤维还相应地降低了β-转角结构的比例（P<0.05）。然而，随着粒径的减小，柚子皮全粉对β-折叠的比例影响较弱，与空白组相比无显著性差异（P ≥0.05）。在鱼糜蛋白的热致凝胶过程中，β-折叠的形成往往伴随着α-螺旋的展开，β-折叠结构促进更有序、更紧凑网络结构的形成[32]。鱼糜蛋白的二级结构对其加工特性影响显著，α-螺旋结构的含量与加工中的凝胶强度密切相关，β-折叠结构则提供了鱼糜凝胶的硬度，β-转角和无规卷曲结构则不能促使生成有序的凝胶网状结构；α-螺旋的降低与β-折叠的增加，被认为与鱼糜凝胶强度和持水性增加密切相关[33-34]。本研究中，与市售膳食纤维类似，较大粒径范围的柚子皮全粉（<150 μm）能够影响鱼丸蛋白二级结构的形成，促进无序结构转变为更有序的凝胶结构；进一步的颗粒微细化处理并不能影响其二级结构的形成。从上述鱼糜蛋白二级结构与加工特性的相关性理论推断，与空白组相比，添加较大粒径范围的柚子皮全粉（<150 μm）以及膳食纤维的鱼丸表现为较高的凝胶强度、硬度和持水性；然而实际测试结果显示，仅<150 μm 的柚子皮全粉可以提高鱼丸的持水性，对其凝胶强度无显著性影响，而明显降低了硬度。这说明不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白二级结构及鱼丸持水性、凝胶强度和质构特性的影响机制需要进一步深入研究。

表2 不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸蛋白二级结构比例的影响Table 2 Effect of different particle sizes of pomelo peel powder on the secondary structure ratio of fish balls protein

3 结论

研究不同粒径的柚子皮全粉对鱼丸品质特性和蛋白二级结构的影响。结果表明：与空白组鱼丸对比，冷藏24 h 后，添加不同粒径的柚子皮全粉和膳食纤维导致冷藏鱼丸的持水力、凝胶强度、硬度和咀嚼性降低（P<0.05）；冻藏7 d 后，添加粒径<150 μm 的柚子皮全粉后，鱼丸的持水力显著高于空白组和添加市售膳食纤维的鱼丸（P<0.05），其凝胶强度和弹性均与空白组无明显差异（P ≥0.05）。说明通过粒径筛选，柚子皮全粉更适用于冻藏鱼丸的生产加工。进一步针对不同粒径的柚子皮全粉影响冻藏鱼丸FTIR 光谱分析结构显示，添加<150 μm 的柚子皮全粉会引起鱼丸β-折叠结构增加，促进蛋白分子凝胶的有序性，然而不同粒径的柚子皮全粉影响鱼丸品质特性的作用机制有待进一步探究。研究结果表明添加一定粒径的柚子皮全粉可以提高鱼糜制品在冻藏过程中的持水性，为功能性鱼丸产品开发及柚子皮的高值利用提供参考。