QuEChERS/气相色谱-串联质谱-内标前置法测定茶叶中37种农药残留

黄 微，马玉凤，孟怡璠，李崇勇*，李春梅，李 婷，王俣心，丁 伟

（1.陕西省茶叶产品质量监督检验中心 汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000；2.城固县食品药品检验检测中心，陕西 汉中 723200）

我国是茶叶主要生产国，也是茶文化的起源国。茶叶因具有独特的风味和保健功能而深受大众喜爱［1］。影响茶叶质量安全的指标主要有农药、真菌毒素、重金属残留等［2］，其中农药残留是最被人们关注的指标之一。茶叶产生农残的原因一方面在于农药的不规范使用，如茶园使用违禁农药、超量喷洒农药、忽视施药安全间隔期等；另一方面在于茶叶种植过程受到外界污染，如土壤、大气、水体中残存的农药向茶叶转移［3］。过高的农药残留严重影响茶叶的质量安全，世界多国对茶叶中农药的最大残留限量（MRL）均做了严格规定。我国2021 年发布的GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》标准［4］中涉及茶叶农药残留的指标有106 项，较2019 版增加了41 项，且降低了部分农药的MRL 数值。限量标准不断从严，体现出我国对茶叶质量安全日益严格的要求。

茶叶中农药残留的检测方法主要有气相色谱法（GC）［5］、气相色谱-质谱法（GC-MS）［6］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）［7］、液相色谱法（LC）［8］、液相色谱-质谱法（LC-MS）［9］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［10］等。由于茶叶成分复杂，基质对目标组分干扰严重，采用GC、LC 可能导致假阳性。GC-MS、LC-MS 虽能准确定性和定量，但与三重四极杆串联质谱相比，其抗干扰能力和灵敏度不够理想。GC-MS/MS和LC-MS/MS具有抗干扰能力强、灵敏度高、准确度高等特点，近年来被普遍应用于茶叶中农残的检测［11］。

常用的茶叶前处理方法主要有振荡提取［6，12］、涡旋提取［9］、超声提取［5，7-8］、加速溶剂萃取［10，13］、固相萃取［10，13］、分散固相萃取［6-7］、固相微萃取［14］、凝胶渗透色谱［7，15］等。QuEChERS法是在分散固相萃取技术基础上发展的一种新型前处理方法，具有快速简单、经济高效、可靠安全等优点，在茶叶农残检测 领 域 得 到 广 泛 应 用［5，8，16-17］。国 家 标 准GB 23200.113-2018［12］、GB 23200.121-2021［18］均 以QuEChERS 法作为前处理方法。为降低分析方法的误差，用QuEChERS 法进行前处理时常采用内标法进行定量。内标法可分为内标前置和内标后置两种方式，内标前置即在样品前处理前加入内标（ISTD），内标后置即在样品前处理后加入内标。传统的内标法选择与目标化合物性质相近的化合物作为内标，一般采用内标后置方式（如GB 23200.113-2018［12］），能够校正信号变化和仪器不稳定性带来的误差，但无法补偿前处理过程造成的待测物损失。同位素内标法选择经同位素标记的化合物作为内标，一般采用内标前置方式［19］，能够较好地消除前处理过程和仪器不稳定性带来的误差，但由于同位素内标物价格昂贵且不易获得，其在茶叶中农药多残留检测中的应用受限。本文拟采用QuEChERS 结合GC-MS/MS 对茶叶中具有代表性的37 种农药残留进行检测（包括14 种有机磷类、10 种有机氯类、8 种拟除虫菊酯类和5 种有机杂环类），以内标前置法加入环氧七氯内标并进行定量，以校正前处理过程中的目标物损失以及仪器测定过程产生的误差，从而建立一种操作简单、快速高效、回收率高、成本低的茶叶中农药残留检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

GCMS-TQ8040 气相色谱-三重四极杆质谱仪、SH-RXi-5Sil MS 石英毛细管色谱柱（日本Shimadzu公司）；IKA VORTEX2涡旋混匀器（德国IKA公司）；MFV-24智能氮吹仪（广州得泰仪器科技有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；MS1003S电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

37种农药标准品和内标环氧七氯（农业部环境保护科研监测所，质量浓度均为100 mg/L）；乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国Mreda公司）；正己烷、丙酮（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）；QuEChERS 萃取盐包（含6 g 硫酸镁、1.5 g 乙酸钠）、QuEChERS 萃取净化管（含1200 mg硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18、400 mg GCB）（月旭科技（上海）股份有限公司）；绿茶、红茶为日常送检样品，白茶、黑茶购于本地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制混合标准工作溶液：分别移取37 种农药标准品（100 mg/L）各1 mL 于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成2 mg/L 的混合标准溶液。取适量混合标准溶液用乙酸乙酯逐级配制成质量浓度分别为0.2、1、2、10、20、100、200、400、800µg/L的系列混合标准工作溶液。

内标溶液：取1 mL 环氧七氯（100 mg/L）于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，配制成5 mg/L的内标溶液。

基质混合标准工作溶液：将空白基质溶液氮气吹干，加入20µL 内标溶液，以1 mL 混合标准工作溶液复溶，过0.22µm有机相微孔滤膜，得到相应质量浓度的基质混合标准工作溶液。

1.2.2 QuEChERS 前处理内标前置法：准确称取2 g（精确至0.001 g）粉碎均匀的茶叶样品置于50 mL 塑料离心管中，加入200 µL 内标溶液和10 mL 水混匀，浸泡30 min。加入20 mL 乙腈，涡旋1 min，超声提取20 min，加入QuEChERS 萃取盐包（含6 g 硫酸镁、1.5 g 乙酸钠），涡旋1 min，5000 r/min 离心5 min。吸取10 mL 上清液加至15 mL 塑料QuEChERS 萃取净化管中（含有1200 mg硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18、400 mg GCB），涡旋1 min，5000 r/min 离心5 min。吸取2 mL净化液于10 mL 塑料试管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙酸乙酯复溶，过0.22 µm 有机滤膜，待检测。

内标后置法：除以下操作外，其余步骤均与内标前置法相同：①茶叶样品置于50 mL 塑料离心管后，不加入200µL内标溶液；②净化液氮气吹至近干后，先加入20µL内标溶液，再加入1 mL乙酸乙酯复溶。

1.2.3 仪器条件气相色谱条件：色谱柱为SH-RXi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25µm）；进样口温度：250 ℃；升温程序：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min 升至125 ℃，再以10 ℃/min 升至300 ℃，保持10 min；进样方式：不分流进样；柱流量：1.5 mL/min；载气：氦气（纯度大于99.999%）；进样量：1µL。

质谱条件：电子轰击离子源（EI）；离子源电压：70 eV；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃；溶剂延迟时间：4 min；碰撞气：氩气（纯度大于99.999%）；扫描方式：多反应离子监测模式（MRM）。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS/MS条件优化

将400µg/L 的37种农药混合标准工作溶液进行单四极杆质谱全扫描，利用谱库检索间接确定各农药的保留时间，通过优化柱箱升温程序，37 种农药可在22.31 min 内得到有效分离。再通过Smart Database MRM 优化工具确定各农药的碎片离子信息和碰撞能量，具体参数见表1。在优化的质谱条件下，37种农药在绿茶空白基质匹配标准溶液（400µg/L）中的总离子流色谱图如图1所示。

图1 37种农药在绿茶空白基质匹配标准溶液（400µg/L）中的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of green tea blank matrix-matched standard solution（400µg/L）of the 37 pesticides

表1 37种农药及内标的保留时间和质谱参数Table 1 Retention times and MS parameters of the 37 pesticides and internal standard

2.2 提取溶剂的选择

茶叶中农药残留检测的常用提取溶剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等。为确定最优的提取溶剂，分别采用乙腈、乙酸乙酯、丙酮、丙酮-正己烷（1∶1，体积比）、正己烷5 种溶剂按照“1.2.2”内标前置法进行绿茶空白基质加标回收实验，37 种农药的加标水平为0.1 mg/kg，所有加标样品均静置24 h以上。结果表明，不同提取溶剂得到的提取液颜色由深至浅分别为丙酮＞丙酮-正己烷（1∶1）＞乙腈＞乙酸乙酯＞正己烷，且用丙酮、丙酮-正己烷（1∶1）两种溶剂提取净化，氮吹后得到的残渣较多。根据GB/T 27404-2008［20］的要求，当待测农药含量为0.1 mg/kg 时，回收率应在80%～110%范围内。通过比较不同溶剂提取后的回收率分布情况（见图2）可知，使用不同提取溶剂时，平均加标回收率在80%～110%范围内的农药数量均不相同，由高到低分别为乙腈（33种）＞乙酸乙酯（27种）＞丙酮（21种）＞丙酮-正己烷（1∶1）＞（20种）＞正己烷（3种）。综上所述，本文最终选择乙腈作为提取溶剂。

图2 不同溶剂提取后37种农药的回收率分布（绿茶基质）Fig.2 Recovery distribution of the 37 pesticides in green tea by different extraction solvents

2.3 加水量的确定

茶叶的含水量较低，前处理过程若加入一定量的水进行浸泡，可以增加茶叶细胞的通透性，从而提高农残的析出。然而，茶叶用水浸泡后，水溶性杂质也随之溶出并转移到提取液中，增加净化难度。加水量越多，水溶性杂质的含量越高，提取液颜色越深，净化难度越大。通过空白基质加标回收实验（加标水平为0.1 mg/kg），分别比较了添加0（即不添加水）、5、10、15 mL水时对37种农药回收率的影响。结果显示，不加水浸泡，大部分农药无法被有效提取，有33种农药的平均回收率在80%以下。加水浸泡后，这一情况得到显著改善。与添加5、15 mL水相比，添加10 mL水时，有32种农药的平均回收率在80%～110%范围内，均高于两者。因此，实验选择加水量为10 mL。

2.4 内标前置法与内标后置法的比较

内标法是质谱分析中常见的定量方法，通过添加内标可以校准前处理和仪器检测过程的偏差。为比较内标的不同放置方式对回收率的影响，按照“1.2.2”分别用内标前置法和内标后置法对绿茶空白基质进行加标回收实验，37 种农药的加标水平为0.1 mg/kg，结果见图3。由图可知，采用内标前置法，平均回收率在80%～110%之间的农药有34种，高于内标后置法（30 种）。另外，平均回收率为80%～110%的大部分农药，采用内标前置法的回收率与100%的绝对差值低于内标后置法。如乙酰甲胺磷、乙螨唑和毒死蜱，用内标前置法时三者的平均回收率分别为91.4%、93.1%和101%，而用内标后置法的平均回收率分别为83.7%、83.8%和89.7%。其原因可能在于，内标后置法是在前处理结束后上机前加入内标，因QuEChERS 方法中无水硫酸镁与水放热导致离心管的温度升高，可能会使农药降解损失，且前处理过程中提取、转移、氮吹等步骤也可能导致农药损失，这些损失无法用内标后置法进行补偿。而内标前置法的内标物是在前处理前加入样品中，整个前处理和仪器分析过程均伴随待测目标物，可以更好地校正前处理和仪器带来的误差，使农药的回收率相对稳定，提高了方法的准确度。

图3 采用内标前置法和内标后置法时37种农药的回收率分布（绿茶基质）Fig.3 Recovery distribution of the 37 pesticides in green tea by adding ISTD before pre-treatment and after pre-treatment

2.5 基质效应

茶叶成分复杂，在质谱分析过程中可能产生基质效应（ME），导致目标化合物在仪器上的响应增强或减弱，不利于农残分析。其计算公式为：ME=B/A×100%，其中，A为纯溶剂标准溶液中农药的响应值，B为空白基质标准溶液中相同含量农药的响应值。ME 低于80%为强基质抑制效应，ME 在80%～100%之间为弱基质抑制效应，ME 在100%～120%之间为弱基质增强效应，高于120%则为强基质增强效应［21］。本文分别用绿茶、红茶、白茶、黑茶空白基质和乙酸乙酯配制质量浓度为200µg/L 的37种农药混合标准溶液，上机测试。结果表明，4 种茶叶均以基质增强效应为主，ME 高于120%的农药数量在4种茶叶中占比均最高，ME低于80%的农药数量在4种茶叶中均为0。本实验采用基质匹配标准曲线进行定量，以消除基质效应的影响。通过比较发现，基质溶液中目标化合物的色谱峰形较好，无拖尾现象，而纯溶剂中部分目标化合物（如甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果等）的色谱峰形较宽，有明显拖尾（图4）。这可能是因为茶叶的基质组分限制了GC 进样口和色谱柱中产生的活性位点，从而改善了农药在纯溶剂中的峰拖尾情况［22］。

图4 纯溶剂标准溶液（A）和绿茶基质标准溶液（B）中甲胺磷（400µg/L）的色谱图Fig.4 Chromatograms of methamidophos（400µg/L）in solvent standard（A）and green tea matrix-matched standard（B）

2.6 线性范围、检出限与定量下限

按照“1.2.1”分别用绿茶、红茶、白茶、黑茶空白基质配制质量浓度为0.2、1、2、10、20、100、200、400、800 µg/L 的系列空白基质混合标准工作溶液，以各农药与内标的峰面积之比为纵坐标，各农药与内标的质量浓度之比为横坐标绘制标准曲线。结果表明，在相应的质量浓度范围内，37种农药在4种茶叶基质中的相关系数（r2）均大于0.99，呈现出良好的线性关系。以信噪比为3（S/N=3）确定方法检出限（LOD），以S/N=10确定方法定量下限（LOQ）。结果显示，37种农药在绿茶基质中的检出限为0.3～15.7µg/kg，定量下限为1.0～52.2µg/kg；在红茶基质中的检出限为0.2～15.5µg/kg，定量下限为0.7～51.8µg/kg；在白茶基质中的检出限为0.2～14.5µg/kg，定量下限为0.8～48.4µg/kg；在黑茶基质中的检出限为0.3～15.3µg/kg，定量下限为0.9～51.1µg/kg。除了乙酰甲胺磷、哒螨灵的定量下限与GB 23200.113标准方法相近外，其余农药的定量下限均低于标准方法的定量下限（为10～50µg/kg［12］），显示出较好的灵敏度。结果亦表明，同一种农药在不同茶叶基质中的检出限、定量下限数值较为接近。表2为37种农药在绿茶基质中的线性关系、检出限与定量下限。

表2 绿茶中37种农药的线性范围、相关系数（r2）、检出限（LOD）、定量下限（LOQ）、加标回收率和相对标准偏差Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs），limits of quantitation（LOQs），spiked recoveries and RSDs of the 37 pesticides in green tea

（续表2）

2.7 回收率与相对标准偏差

对空白绿茶、红茶、白茶和黑茶样品进行37 种农药的加标回收实验，加标水平为LOQ、2LOQ 和10LOQ，每个水平重复6 次。结果显示，在不同茶叶以及不同加标水平下，37 种农药的回收率为70.2%～120%，相对标准偏差（RSD）为1.1%～11%，符合GB/T 27404-2008［20］的要求，表明方法的准确度和精密度均能达到满意结果。表2为37种农药在绿茶基质中的回收率与相对标准偏差。

2.8 与文献方法的比较

将本文建立的方法与文献报道［23-28］的茶叶农残检测方法进行比较，结果见表3。本文采用的QuEChERS 前处理方法有机溶剂用量较少，环境友好，操作简单，耗时短；运用内标前置方式结合GC-MS/MS 检测，方法的灵敏度高、回收率好、精密度高。文献［28］方法与本方法相似，利用QuEChERS和GC-MS/MS检测茶叶中31种农药残留，但采用内标后置法，其检出限高于本方法，且回收率不理想。

表3 本方法与文献方法的比较Table 3 Comparison of this method with other methods from references

2.9 实际样品的测定

利用本方法对2021年下半年至2022年一季度送检的27份绿茶（主要为汉中仙毫、汉中毛尖、汉中炒青等汉中本地茶叶）、11 份红茶以及市售的8 份白茶、10 份黑茶进行37 种农药残留的检测。结果显示，在56份茶叶中，有11份检出农药残留，检出率为19.6%。共检出9种农药，检出频次由高到低分别为氯氟氰菊酯（6次）、联苯菊酯（6次）、毒死蜱（6次）、氯氰菊酯（4次）、甲氰菊酯（4次）、氧乐果（4次）、乐果（2 次）、苯醚甲环唑（2 次）、氰戊菊酯（1 次）。以上检出农药的含量均未超过GB 2763-2021 规定的最大残留限量值。

3 结论

本文利用QuEChERS 前处理技术，采用内标前置方式，建立了茶叶中37种农药残留的气相色谱-串联质谱检测方法。通过优化提取条件和内标加入方式，以及采用基质匹配标准曲线定量，解决了前处理过程因目标物损失导致的回收率不高的问题，降低了基质干扰，提高了结果的准确性和稳定性。本方法具有操作简单、准确高效、成本较低等优点，满足日常检测要求，为大批量茶叶农药残留检测提供了新的途径。