磁性氧化石墨烯分散固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定PVC儿童用品中内分泌干扰物迁移量

曹 慧，张 慧，杨 春，姜 侃，王 瑾

（1.浙江省产品质量安全科学研究院，浙江 杭州 310013；2.浙江科技学院，浙江 杭州 310023）

儿童用品的质量安全直接关系着儿童的身体健康。有害化学物质是影响儿童用品质量安全的重要因素，这些物质通过儿童接触相关用品后进入体内，对儿童造成慢性积累性伤害。以双酚A 和壬基酚为代表的内分泌干扰物是一类会引起儿童性早熟的有害物质，通常作为助剂添加在PVC 材质的儿童用品中。

美国、加拿大、欧洲和日本等国家不允许在婴幼儿产品中使用双酚A。欧盟2017/898 号指令针对玩具的双酚A 迁移限值为0.1 mg/L，而对于不足36 个月龄幼儿使用的玩具或其他可放入口中的玩具则减至0.04 mg/L［1］。近年来，作为双酚A 替代品的双酚S、双酚F、双酚E等多种内分泌干扰物质被逐步应用于PVC 材质中。儿童通过日常皮肤接触或舔舐行为，经汗液和唾液将用品中的内分泌干扰物摄入体内，从而影响身体健康，因此有必要开展PVC儿童用品中内分泌干扰物迁移量的研究。

内分泌干扰物的检测方法主要为液相色谱法［2-3］、气相色谱-质谱法［4-5］和液相色谱-串联质谱法［6-9］，其中气相色谱-质谱法需进行衍生［10-11］，操作繁琐，且衍生化试剂毒性大，液相色谱-串联质谱是较为理想的检测方法。目前已有关于内分泌干扰物迁移量的报道［12-14］，但主要针对食品包装材料采用食品模拟液开展迁移研究［15-16］，尚无关于PVC 儿童用品中内分泌干扰物在人工模拟汗液和人工模拟唾液中迁移量的报道。

人工模拟汗液和人工模拟唾液由于含有大量的盐，不能直接进行质谱分析，需先对迁移物进行富集洗脱。磁性氧化石墨烯材料作为一种新型的碳纳米材料，具有吸附性能强、分离方便、操作简单、化学性能稳定等优点，被应用于样品前处理中［17-20］。本研究拟以磁性氧化石墨烯为分散固相萃取材料，富集净化人工模拟汗液和人工模拟唾液中的双酚A 等14种内分泌干扰物，结合液相色谱-串联质谱技术分析PVC儿童用品中内分泌干扰物的迁移量，为儿童用品的风险监测提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LC-20AD 高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；QTRAP5500 三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；电子天平（梅特勒-托利多公司）；涡旋混合器（太仓市华利达实验设备有限公司）；固相萃取装置（美国Waters公司）。

1.2 材料与试剂

双酚A（BPA，纯度99.9%）：上海安谱实验科技股份有限公司产品；双酚E（BPE，纯度100.0%）、双酚F（BPF，纯度99.9%）、双酚S（BPS，纯度99.8%）、4-正辛基酚（4-n-OP，纯度99.8%）、4-壬基酚（4-NP，纯度99.4%）、4-正壬基酚（4-n-NP，纯度99.4%）：北京Bepure 公司产品；双酚B（BPB，纯度98.0%）、双酚AF（BPAF，纯度99.9%）、双酚AP（BPAP，纯度99.9%）：美国TRC 公司产品；四溴双酚A（TBBPA，纯度98.0%）：美国Chem Service 公司产品；双酚Z（BPZ，纯度99.8%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 产品；四氯双酚A（TCBPA，纯度99.7%）、辛基酚（OP，纯度98.0%）：美国AccuStandard 公司产品。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL/60 mg，美国Waters公司）；磁性氧化石墨烯（直径：＜5µm，Fe3O4直径：～10 nm）：南京先丰纳米材料科技有限公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：AtlantisTMT3（150 mm×2.1 mm，3µm）；柱温：40 ℃；进样量：5.0µL；流速：0.4 mL/min；流动相：A 为甲醇-乙腈（1∶1，体积比），B 为水。梯度洗脱程序：0～1 min，80%B；1～4 min，80%～5%B；4～8 min，5%B；8～8.2 min，5%～80%B；8.2～10 min，80%B。

1.3.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描模式：负离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：-4500 V；离子源温度：550 ℃；喷雾气：345 kPa；辅助加热气：379 kPa；气帘气：241 kPa。

1.4 溶液配制方法

1.4.1 标准溶液配制准确称取14种待测物标准品10 mg，用甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，配成1 mg/mL 的标准储备液。分别准确移取标准储备液500 µL 至50 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至50 mL，稀释成质量浓度为10.0µg/mL 的标准中间液。分别移取适量的标准中间溶液，用基质提取液稀释配制成系列混合标准工作溶液，其中双酚A、双酚E、双酚F、双酚AP、双酚B、双酚Z、四溴双酚A、4-壬基酚、4-正壬基酚、辛基酚、4-正辛基酚的质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 µg/L，双 酚S、双 酚AF、四 氯 双 酚A 的 质 量 浓 度 为0.1、0.2、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0µg/L。

1.4.2 人工模拟液配制 分别称取5.00 g 氯化钠、1.00 g 尿素和1.00 g 90%的乳酸于900 mL 纯水中，用1%的氢氧化钠溶液调至pH 6.5，定容至1 L，作为人工模拟汗液。分别称取0.17 g 氯化镁、0.15 g氯化钙、0.76 g磷酸氢二钾、0.53 g碳酸钙、0.33 g氯化钠和0.75 g氯化钾于900 mL 纯水中，用1%的盐酸溶液调至pH 6.8，定容至1 L，作为人工模拟唾液。

1.5 样品前处理方法

1.5.1 样品迁移儿童用品在人工模拟汗液和人工模拟唾液的迁移方法尚无相关标准。由于本文以玩具作为研究对象，故参考标准GB/T 38420-2019［21］，以每1 cm2儿童用品接触10 mL 人工模拟液进行迁移实验。试样于室温下在人工模拟液中浸泡2 h，将浸泡液涡旋30 s后待净化。

1.5.2 样品净化准确称取10 mg磁性氧化石墨烯，加入浸泡液，涡旋混合15 min，在外磁场的作用下弃去上清液。加入3 mL 含有1%甲酸的丙酮，涡旋混合15 min，在外磁场的作用下取出上清液，氮气吹至近干，以初始流动相定容至2.0 mL，过滤膜后待测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

色谱柱的性能直接影响化合物的分离，实验比较了Kinetex C18（100 mm × 2.1 mm，2.6 µm）、Kinetex F5（150 mm×3.0 mm，2.6µm）、Kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6µm）、AtlantisTMT3（150 mm×2.1 mm，3 µm）、XBridge C18（150 mm × 2.1 mm，1.7 µm）5 种色谱柱的分离效果。结果表明，使用AtlantisTMT3色谱柱时，14 种内分泌干扰物的响应和峰形优于其他色谱柱。进一步比较了AtlantisTMT3色谱柱长度分别为100 mm 和150 mm 时的分离效果，发现长度为100 mm 的色谱柱较150 mm 的色谱柱出峰快，同分异构体不能有效分离。因此，选择AtlantisTMT3（150 mm × 2.1 mm，3 µm）色谱柱进行实验。

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈（1∶1）-水作为流动相时对14种内分泌干扰物的分离效果。实验发现，有机相采用甲醇体系时待测物的分离效果佳，但出峰晚、峰形不尖锐；采用乙腈体系时待测物的分离效果差，但出峰早、峰形佳；采用甲醇-乙腈（1∶1）体系时，14 种待测物的分离效果最佳，且峰形尖锐。尝试在流动相中加入0.1%氨水或0.1%甲酸，通过调节pH 值来影响待测物的离子化效率，结果表明，加入0.1%甲酸会抑制待测物的离子化效率，0.1%氨水的离子化效率不如水体系佳，因此采用甲醇-乙腈（1∶1）和水作为流动相。图1 为优化条件下14 种内分泌干扰物的色谱图。

图1 14种内分泌干扰物的色谱图Fig.1 Chromatogram of 14 endocrine disruptors the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 质谱条件的优化

采用针泵进样分别对14种内分泌干扰物进行母离子扫描，在电喷雾负离子模式下获得准分子离子峰，对每种化合物的母离子分别进行二级碎片扫描，得到碎片离子信息。选取2 个响应高、干扰小的碎片作为该化合物的子离子，并优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）等参数，14 种待测物的质谱参数见表1。

表1 14种内分泌干扰物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 14 endocrine disruptors

2.3 样品净化条件的优化

2.3.1 磁性氧化石墨烯用量的影响考察了磁性氧化石墨烯用量分别为2、5、10、15、20 mg 时14 种待测物的回收率（见图2）。结果表明：随着磁性氧化石墨烯用量的增加，14 种待测物的回收率随之增加，当用量达到10 mg 后，14 种待测物的回收率趋于稳定。由于磁性氧化石墨烯用量少时，通过外加磁场易于分离；用量大时，分离速度缓慢。综合考虑，选择磁性氧化石墨烯的用量为10 mg。

图2 磁性氧化石墨烯用量对14种待测物萃取效率的影响Fig.2 Effect of dosage of magnetic graphene oxide on the extraction efficiencies of 14 analytes

2.3.2 吸附时间的影响考察了不同吸附时间（5、10、15、20、25 min）下14种待测物的回收率。结果表明：随着吸附时间的增加，14种待测物的回收率随之增加，当吸附时间为15 min时，14种待测物的回收率最佳，之后回收率变化不明显。因此，选择吸附时间为15 min。

2.3.3 洗脱溶剂种类及用量的影响分别选取含1%甲酸的甲醇、乙腈、乙醇、丙酮作为洗脱溶剂，考察了14 种待测物的回收率（见图3）。结果表明：含1%甲酸的丙酮作为洗脱溶剂时回收率最佳，故采用1%甲酸的丙酮作为洗脱溶剂。

图3 洗脱溶剂种类对14种待测物萃取效率的影响Fig.3 Effect of desorption solvent on the extraction efficiencies of 14 analytes

分别选取1、2、3、4、5 mL含1%甲酸的丙酮进行洗脱，考察了洗脱溶剂用量对待测物回收率的影响。结果表明：随着洗脱溶剂体积的增加，14 种待测物的回收率增大，当洗脱溶剂体积为3 mL 时，14 种待测物的回收率最大且趋于稳定，因此选择洗脱溶剂体积为3 mL。

2.3.4 洗脱时间的影响以3 mL 含1%甲酸的丙酮作为洗脱溶剂，分别考察了不同洗脱时间（5、10、15、20、25 min）下14 种待测物的回收率（见图4）。结果表明：随着洗脱时间的增加，14 种待测物的回收率增大，当洗脱时间为15 min 时，14 种待测物的回收率趋于稳定，因此选择洗脱时间为15 min。

图4 洗脱时间对14种待测物萃取效率的影响Fig.4 Effect of desorption time on the extraction efficiencies of 14 analytes

2.4 磁性氧化石墨烯的重复利用性能

按“1.5.2”净化条件对磁性氧化石墨烯材料进行反复10次吸附和脱附实验，考察14种待测物的回收率。结果表明：10 次实验中14 种待测物的回收率均在80%～120%范围内，说明磁性氧化石墨烯反复使用10次后，回收率能满足分析要求。

2.5 基质效应

基质效应（ME）在质谱分析中普遍存在，需要进行考察评价。分别用纯溶剂和基质空白溶液稀释标准中间液配制成系列标准工作溶液，采用建立的方法进行测定，通过ME=［（基质溶液标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率）-1］×100%评价基质效应，ME 的绝对值小于20%时说明基质效应弱，ME 的绝对值为20%～50%时说明基质效应中等，大于50%时说明基质效应强。表2结果表明，部分化合物表现为中等基质效应，为消除基质效应的影响，采用基质空白溶液配制标准溶液进行定量分析。

2.6 线性方程、检出限与定量下限

采用本方法测定“1.4.1”配制的系列混合标准工作溶液，以待测物的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见表2）。结果显示，14 种待测物在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9901～0.9992，检出限和定量下限分别为0.1 ～0.5µg/L和0.3 ～1.5µg/L。

表2 14种内分泌干扰物的线性关系、基质效应、检出限与定量下限Table 2 Linear relations，ME，LODs and LOQs of 14 endocrine disruptors

2.7 回收率与相对标准偏差

取阴性样品分别在人工汗液和人工唾液模拟物基质中添加低、中、高3 个水平的混合标准溶液，每个浓度进行6次平行实验，按“1.5”方法进行前处理，采用“1.3”仪器条件进行检测（见表3）。结果表明：人工汗液中14种待测物的回收率为80.2%～103%，相对标准偏差（RSD）为1.2%～6.8%；人工唾液中的回收率为80.9%～105%，RSD为1.0%～6.4%。

表3 14种内分泌干扰物的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 14 endocrine disruptors（n=6）

2.8 与商品化固相萃取柱的比较

取阴性样品分别在人工汗液和人工唾液模拟物基质中添加中等浓度的混合标准溶液，分别采用Oasis HLB 固相萃取柱和磁性氧化石墨烯进行前处理，进行6次平行实验，比较商品化固相萃取柱和磁性氧化石墨烯的吸附效果。结果表明：使用Oasis HLB 前处理时14种待测物的回收率为80.8%～105%，RSD 为0.90%～6.9%；使用磁性氧化石墨烯前处理时14 种待测物的回收率为81.9%～99.8%，RSD 为0.50%～5.7%。说明磁性氧化石墨烯与商品化固相萃取柱的富集净化效果相当。磁性氧化石墨烯可均匀分散于溶液中，通过磁性进行收集，可重复使用，因此与Oasis HLB 相比不仅操作简便，且降低了实验成本。

2.9 样品测定

采用本方法对25 份PVC 儿童用品进行人工汗液和人工唾液模拟物中14 种待测物迁移量的测定，发现阳性样品5份，阳性检出率为20.0%，阳性样品均含有双酚A和双酚S，部分样品含有4-壬基酚（见表4）。结果表明：双酚A、双酚S和4-壬基酚在人工汗液和人工唾液中均会产生迁移，且迁移量相似，迁移量分别为14.1～268.9µg/L、0.3～7.8µg/L和1.7～4.6µg/L。个别儿童用品中双酚A的迁移量较高，会对儿童的身体健康造成危害。

表4 14种内分泌干扰物的迁移量结果Table 4 The migration results of 14 endocrine disruptors

3 结论

本文建立了磁性氧化石墨烯固相萃取/液相色谱-串联质谱技术测定PVC儿童用品中14种内分泌干扰物迁移量的检测方法，迁移至人工汗液和人工唾液中的内分泌干扰物通过磁性氧化石墨烯富集净化，经液相色谱-串联质谱定量分析。在最佳分析条件下，14种物质的线性相关系数为0.9901～0.9992，检出限为0.1～0.5µg/L，定量下限为0.3～1.5µg/L，加标回收率为80.2%～105%，RSD为1.0%～6.8%。该方法操作简单、分析速度快、重现性好，适用于PVC儿童用品中内分泌干扰物迁移量的测定。