高灵敏ECL-RET传感器的构建及其用于血清前列腺特异性抗原检测的研究

孙莹莹，张佳佳，王 丹，王 蔚，郭胜男

（辽宁中医药大学 医学检验学院，辽宁 沈阳 110847）

前列腺癌是男性最常见的癌症之一，作为一种严重的泌尿系统疾病，其死亡率在男性癌症中排第二位，对男性的健康状况危害极大。早在1980 年，血清前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen，PSA）就被认为是前列腺癌早期诊断和治疗中最重要的生物标志物［1］。一般认为PSA 正常值小于4 ng/mL，而癌症患者血清中的PSA 含量高于10 ng/mL［2］。然而，有研究人员发现，如果人血清中的PSA 含量上升到2 ng/mL 时，患前列腺癌的风险就大大增加［3］。目前，许多检测方法已用于分析血清PSA，如酶联免疫吸附试验（ELISA）［4］、化学发光免疫分析［5］、荧光免疫分析［6］和质谱免疫分析［7］。虽然这些方法可提供可靠的测试结果，但检测过程复杂、耗时，价格昂贵，灵敏度不高。因此，快速、灵敏检测血清中的PSA对前列腺癌的早期诊断具有重要意义。

电化学发光法（ECL）作为化学发光与电化学技术相结合的产物，具有灵敏度高、背景低、操作简单、无污染等优点，目前被广泛应用于生化分析、食品农药检测等领域［8-9］。在众多的ECL 发光材料中，量子点以其独特的高量子产率、低光漂白和高稳定性等优点受到广泛关注［10］。然而，一般的二元量子点多由Ⅱ～Ⅵ族（如CdSe、CdTe等）或Ⅳ～Ⅵ族（如PbSe、PbS等）元素组成，但重金属元素存在毒性，严重限制了量子点在生化分析中的应用［11］。近年来，有学者合成出四元Cu-Zn-In-S 半导体纳米晶（NCs）［12］。作为一种无镉型的量子点，四元Cu-Zn-In-S除了具有优异的光电性能、可调节的带隙宽度等优点外，还具有细胞毒性低、生物相容性好等特点［13-14］。因此，四元Cu-Zn-In-S 纳米晶普遍应用于生物医学成像领域［15］。2018 年本课题组发现，在共反应剂存在的条件下，NCs 具有与二元量子点相似的发光信号［16］，其发光信号稳定，强度甚至高于传统量子点，这说明NCs 可在电极表面发生氧化还原反应并产生激发态。

电化学发光共振能量转移（ECL-RET）是一种基于电化学发光体与光谱匹配的能量受体之间的共振能量转移的分析策略。这种分析手段具有灵敏度高、仪器设备简单、不受散射光干扰等优点，因此在电化学生化分析领域具有极大潜力［17-19］。ECL-RET 发生的前提条件是发光体的发射光谱需与能量受体的吸收光谱有效重叠［20］。迄今为止，半导体纳米晶和贵金属纳米粒子作为发光体/能量受体对获得了广泛的研究。例如，Shan 等［21］报道了Mn 掺杂的CdS 与AuNPs 两者之间的ECL-RET，并将其用于DNA 的精准检测。He等［22］基于CdS量子点发光体与AuNP 能量受体之间的相互作用，构建了一种灵敏检测钾离子的ECL-RET策略。

本文制备了一种四元Cu-Zn-In-S半导体纳米晶，以其为ECL发光体，金纳米星（AuNSs）作为猝灭探针，K2S2O8作为共反应剂，发展了一种基于量子点ECL-RET的免疫传感器用于PSA检测的分析方法。在优化条件下，该传感器表现出较好的分析性能，用于人血清样品中PSA 的检测，所得结果与标准的化学发光法基本吻合，相对误差较小，结果准确度良好，具有极好的临床应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外可见吸收光谱由UV-2100 型紫外-可见分光光度计（北京瑞利公司）获得；荧光发射光谱由日立F-7000 荧光分光光度计（日本）记录；日立H-7650 透射电子显微镜（TEM）用于纳米材料的形貌表征；电化学阻抗谱（EIS）由CHI 660B 电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）记录，电解质溶液由5 mmol/L 的K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］（1∶1）混合溶液组成，在电位Eo=0.17 V 下进行，频率范围从0.01 Hz到100000 Hz；电化学发光数据在MPI-E型电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）上获取，PMT为800 V，放大倍数为3。

Anti-PSA Ab1（PSA 抗体1）、Anti-PSA Ab2（PSA 抗体2）、PSA 抗原、牛血清蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）购于上海生工生物工程公司；临床血清样本由辽宁中医药大学附属医院提供；多壁碳纳米管（MWNTs，≥99%，直径10～30 nm）购自深圳纳米港有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC，98%）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS，97%）购自Alfa Aesar 公司；1-十八烯（ODE，90%）、醋酸铟（99.99%）、乙酸亚铜、十二烷基硫醇（DDT，99.99%）、油酸（99%）、醋酸锌（99.99%）、油胺（97%）、硫粉（99.98%）、壳聚糖（CHIT，分子量100000～300000，脱乙酰度＞95%）均从Sigma-Aldrich 获得；氯金酸（HAuCl4）等其他分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。所有试剂使用时未进行纯化。实验用水为超纯水。PBS缓冲液pH 值均为7.4，浓度为0.1 mol/L。除特别提及，所有实验均在室温下进行。

1.2 四元Cu-Zn-In-S半导体纳米晶制备

通过一锅法合成四元Cu-Zn-In-S 半导体纳米晶［16］（NCs）。室温下，将乙酸亚铜（2 mg，0.1 mmol）、醋酸锌（18 mg，0.1 mmol）、醋酸铟（29 mg，0.1 mmol）、十二烷基硫醇（DDT，2 mmol）和油酸（0.6 mmol）以及4 mL 1-十八烯（ODE）放入三颈烧瓶中。向体系中不间断通入惰性气体（氩气），同时将烧瓶加热至210 ℃，直至形成透明溶液。然后，将溶解于0.5 mL 油胺中的硫溶液（0.3 mmol）快速注入上述混合物中，反应10 min，再加热至230 ℃反应5 min。颗粒生长完成后，将反应混合物冷却至室温，加入10 mL己烷。用甲醇连续萃取去除副产物，直至甲醇相澄清。

通过对合成的NCs 表面配体的替换实现纳米晶的相转移［23］。将上述NCs 沉淀溶解于2 mL 氯仿中，加入2 mL 含3-巯基丙酸（MPA）的水溶液，剧烈搅拌2 h 后，对该溶液进行反复离心提纯，去除多余的MPA。所得水溶性NCs储存于4 ℃下冰箱中待用。

1.3 金纳米星（AuNSs）与Ab2-AuNSs的制备

采用Liu 等［24］提出的方案一步合成金纳米星（AuNSs）：配制100 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液，并用1 mol/L NaOH 将pH 值调节至7.4 ± 0.1。然后，将4 mL 上述HEPES 与3 mL 水混合，在37 ℃下加入150µL 10 mmol/L 的HAuCl4溶液。在静置状态下反应30 min，溶液颜色从浅黄变为淡紫，最后变为蓝绿时，表明AuNSs已形成。

Ab2-AuNSs 的制备：取3 mL AuNSs 溶液，加入一定量的1% K2CO3溶液调节pH 值后，缓慢加入12µg/mL的Ab2抗体，搅拌反应40 min后，加入100µL 10%BSA 封闭30 min后，将溶液置于离心机内离心20 min（4 ℃，10000 r/min），弃去上清液，沉淀物用PBS重悬，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4 ECL-RET免疫传感器的组装

ECL-RET传感器的构建过程如图1所示：将5.0 mg CHIT溶解于5 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，用NaOH溶液调节pH值至7.0，配制成1.0 mg/mL的CHIT溶液。称取酸化后的MWNTs 1.0 mg加入到1 mL上述CHIT溶液中，超声分散1 h，得到均匀分散的MWNTs-CHIT混合体系。将玻碳电极（GCE）表面处理干净后，采用滴涂法取6µL MWNTs-CHIT溶液滴至GCE表面，室温晾干，使其形成一层均匀致密的薄膜。随后将含有10 mg/mL EDC 和20 mg/mL NHS 的8µL NCs 溶液滴涂于上述GCE/MWNTs-CHIT 表面，得到GCE/MWNTs-CHIT/NCs电极。室温干燥后，将10µL Ab1（10µg/mL）滴加到电极表面，4 ℃下孵育2 h后，用PBS洗涤，并用BSA溶液封闭非特异性结合位点。反应进行1 h后，将不同浓度的PSA底液滴加到上述修饰电极表面，37 ℃恒温孵育1 h。进一步加入10µL的Ab2-AuNSs（10µg/mL）溶液，以形成三明治夹心结构，得到GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs。采用电化学交流阻抗法研究其组装过程，电化学发光法检测不同PSA浓度下传感器发光信号的变化，从而实现PSA浓度的定量检测。

图1 ECL-RET传感器检测PSA 的示意图Fig.1 ECL-RET immunoassay schematic for PSA detection

2 结果与讨论

2.1 纳米材料的形貌表征

通过一锅法合成出的NCs不仅具有优异的发光效率，而且可以通过改变Zn/In的比例得到不同发射波长的量子点。若将Zn/In 比设定为1/1，得到的NCs荧光发射波长为690 nm（图2曲线a）。用透射电镜（TEM）对NCs形貌进行表征（图3A），可看出，NCs具有单分散特性，平均直径为（4.6±0.5）nm。实验所用AuNSs 通过一步合成法制备，即向HAuCl4溶液中加入特定的还原剂（HEPES）后一步生成金纳米星。图3B为AuNSs 的透射电镜图，从图中可看出，晶体表面有多个尖端，属于典型的星状结构，其直径约为（35 ± 5）nm，尖端长度约15 nm。通过对其紫外可见吸收光谱图进行分析（图2 曲线b），发现AuNSs 具有两个明显的LSPR 峰，其中一个较强的纵向吸收峰在670 nm 处，另外一个较弱的横向吸收峰在520 nm处。当与Ab2结合后，AuNSs的纵向吸收峰发生明显红移，峰位出现在690 nm处（图2曲线c）。同时，两个吸收峰的峰宽也略有增加，这表明AuNSs 与Ab2 成功结合［25］。红移后AuNSs 的纵向吸收光谱与NCs的荧光发射光谱重叠，确保了AuNSs与NCs之间发生ECL-RET的可能。

图2 NCs（a）的荧光发射光谱，及AuNSs（b）、Ab2-AuNSs（c）的紫外可见吸收光谱Fig.2 Fluorescence spectrum of Cu-Zn-In-S NCs（a），UV-Vis absorption spectra of AuNSs（b）and Ab2-AuNSs（c）

图3 NCs（A）及AuNSs（B）的TEM图Fig.3 TEM images of NCs（A）and AuNSs（B）

2.2 ECL-RET免疫传感器的组装原理及过程表征

在电极的组装过程中，首先将修饰了NCs的MWNTs-CHIT作为纳米基底固载Ab1，随后利用三明治夹心免疫反应将修饰AuNSs 的二抗（Ab2-AuNSs）组装到电极表面，AuNSs 与电极表面的NCs 发生能量转移，NCs 的ECL 信号被猝灭，通过测定NCs 的电化学发光信号情况，可定量检测底液中的PSA 浓度。采用电化学交流阻抗法（EIS）对上述ECL-RET免疫传感器的组装过程进行跟踪表征。如图4所示，裸GCE 的阻抗谱近乎直线（曲线a），表明该电极Ret很小。当将MWNTs-CHIT 和NCs 修饰在电极表面后，Ret稍有增加（曲线b），说明MWNTs-CHIT/NCs薄膜能够阻碍电极表面的电子转移。随后，在GCE/MWNTs-CHIT/NCs上修饰Ab1和BSA，EIS半圆大幅度增加，Ret增大（曲线c），这是由于蛋白质的绝缘效应阻碍了电子传递。而当PSA被Ab1捕获和加入Ab2-AuNSs后，电阻进一步增大（曲线d、e），说明电极表面形成了稳定的三明治结构，传感器成功构建。

图4 不同修饰电极的EIS谱Fig.4 EIS curves of modified GCE at different stagesa：bare GCE，b：GCE/MWNTs-CHIT/NCs，c：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1，d：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA，e：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs

2.3 ECL-RET免疫传感器的可行性分析

为验证该方案的可行性，考察了ECL-RET免疫传感器在检测PSA前后的ECL信号变化（图5）。在共反应剂K2S2O8存在下，当电极表面未检出PSA时，传感器产生强烈的发光信号（曲线a），发光强度为3301 a.u.，信号非常稳定，说明NCs 在电极表面形成的薄膜可作为发光体构筑ECL-RET 免疫传感器。当PSA存在时，传感器的ECL急剧下降（曲线b），发光强度仅为402 a.u.，猝灭效率高达88%。表明PSA 存在时，抗体之间形成稳定的三明治夹心结构，Ab2-AuNSs 被成功组装到电极表面，NCs 与AuNSs 之间产生有效的RET 效应，从而发生ECL 信号的猝灭。实验结果表明，通过测定传感器ECL 信号的变化实现溶液中PSA含量的检测是切实可行的。

图5 不同电极在5 mmol/L K2S2O8 溶液中的ECL图Fig.5 ECL curves of different electrodes in 5 mmol/L K2S2O8a：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1，b：GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1/PSA/Ab2-AuNSs，c：GCE/CHIT/NCs/Ab1

为证明MWNTs 在ECL-RET 免疫体系中的信号放大的作用，进行了对比实验。采用CHIT 作为基底直接固载NCs，从图中可以看到，GCE/CHIT/NCs/Ab1 的ECL 信号明显低于GCE/MWNTs-CHIT/NCs/Ab1（曲线c），其发光强度仅为1815 a.u.，说明以MWNT作为固定化基底不仅可增大电极的比表面积，使Ab1 的负载量成倍增加，而且由于其优异的导电性和生物相容性，能够最大程度地保持抗体活性，增加电子转移速率，具有很强的信号放大作用。

2.4 实验条件的优化

为选择合适的pH值，实验考察了pH值对ECL猝灭效率的影响，如图6A所示，随着pH值的增加，传感器的ECL猝灭效率逐渐升高，而当pH值大于7.4时，猝灭效率大幅度降低。实验选择pH 7.4为最佳酸度。

图6 不同实验条件对传感器性能的影响Fig.6 Effect of different experimental conditions on ECL quenching efficiency of the proposed immunosensing systemA：pH value of PBS，B：volume of MWNTs-CHIT；C：concentration of K2S2O8

研究了MWNTs-CHIT 的滴涂量对传感器性能的影响（图6B）。结果显示，当MWNTs-CHIT 体积从2.0µL 增加到6.0µL 时，ECL 的猝灭效率逐渐增加，当体积大于6.0µL 后，猝灭效率反而急剧下降。这是因为MWNTs 能够有效增加电极的比表面积，提高电子转移速率，但过量的MWNTs 会导致ECL背景信号的增加，电子转移速率反而降低。因此实验采用6.0µL作为MWNTs-CHIT的成膜体积。

进一步考察不同浓度K2S2O8对信号的影响（图6C）。结果显示，随着K2S2O8浓度从1 mmol/L 增加到5 mmol/L，ECL的猝灭效率持续升高，当浓度超过5 mmol/L，猝灭效率呈下降趋势。本实验选择5 mmol/L作为K2S2O8的最佳浓度。

2.5 ECL-RET免疫传感器的性能分析

在最佳实验条件下，利用制备的ECL-RET 免疫传感器对不同浓度的PSA 进行定量检测，结果如图7A所示。随着PSA浓度的增大，ECL强度逐渐减弱，当PSA的浓度在0.01～150 ng/mL之间时，ECL猝灭效率与logc呈良好的线性关系，拟合方程为ΔIECL= 0.4513 logc+ 0.1883（r2= 0.998），检出限（S/N=3）为0.03 ng/mL。与文献相比［26-29］，该传感器表现出较宽的检测范围和较低的检出限，表明该传感器在PSA检测中具有突出潜力。

通过对孵育50 ng/mL PSA 后的传感器进行连续扫描300 s测定其稳定性，结果显示，ECL信号无明显变化（RSD=1.1%），表明该传感器具有优良的稳定性。为了考察ECL-RET 免疫传感器对PSA 的特异性，本实验选择牛血清白蛋白（BSA）、甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）作为可能的干扰蛋白进行实验（如图7B）。结果发现上述干扰蛋白对传感器的检测干扰几乎可以忽略。在相同实验条件下，传感器检测纯样品和混合干扰蛋白样品的ECL猝灭效率基本一致，说明传感器具有较高的选择性。

图7 不同浓度PSA的ECL响应曲线（A）及ECL-RET传感器的选择性（B）Fig.7 ECL responses of ECL-RET immunosensor with different concentrations of PSA（A），and selectivity of ECL-RET immunosensor（B）inset：calibration plot of ECL quenching efficiency with logarithmic value of PSA concentration

2.6 实际样品分析

为了评价ECL-RET 免疫传感器在临床PSA 检测中的可行性，将传感器用于成年男性血清样本中PSA 浓度的检测，结果如表1 所示。临床血清样本按照以下程序制备［30］：将5 mL 全血放入试管中以3000 r/min 离心10 min，然后将血清等量转移至1.5 mL 试管中备用。分别用常用的化学发光法［31］和ECL-RET免疫传感器法对样品进行检测。通过对比发现，ECL-RET免疫传感器的测试结果与常用方法吻合，相对误差范围为-7.2%～6.0%，说明该方法对人血清样本中的PSA 抗原具有良好的准确性，该方法具有较好的临床应用前景。

表1 利用ECL-RET与化学发光法检测人血清样本中PSA的数据比较Table 1 Comparison of ECL-RET immunosensor with chemiluminescence（CL）immunoassay for clinical PSA detection

3 结论

本文首次基于NCs（发光体）与AuNSs（受体）的ECL-RET，采用K2S2O8作为共反应剂，制备了一种高灵敏检测PSA 的猝灭型ECL 免疫传感器。首先，利用一锅法合成四元Cu-Zn-In-S 纳米晶（NCs），并将其作为发光体固载于修饰了MWNTs的基底表面。该电极表现出极强的初始ECL信号和较低的ECL电位。随后，利用三明治夹心免疫反应将PSA 和修饰了AuNSs 的二抗（Ab2-AuNSs）组装到电极表面，通过AuNSs 与NCs 之间的有效ECL-RET，使得电极的ECL 信号显著下降，从而实现PSA 的检测。该传感器不仅灵敏度高、检测范围宽，还具有选择性好、稳定性高等特点。将该方法应用于人血清样本检测，其准确率高、误差小，为临床PSA的检测提供了一种新方法。