GC-MS/MS法测定白酒中8种有机磷酸酯化合物

詹重清

（福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心，福建 福州 350002）

有机磷酸酯（Organophosphate Esters，OPEs）是一种用途广泛的添加材料，具有阻燃、润滑、消泡、耐热、增塑、耐腐蚀等性能，主要应用于建材、纺织、玩具、电子元器件及食品行业中[1-3]。有机磷酸酯类化合物在使用时主要是通过物理方式添加到产品中，因此，OPEs与各类材料的结合并不牢固，在使用过程中能够通过磨损、挥发等方式扩散逃逸到环境中[4]。2011～2018年全球的有机磷酸酯使用量从50万吨增加到280万吨[5]，这给环境保护带来了不小的压力和挑战。当前，已有报道指出在水体、大气、室内灰尘、土壤沉积物、动植物以及人体内检测出了相当含量的OPEs[3，6-12]，同时，也有研究指出有机磷酸酯类化合物有神经和生殖毒性，能够致癌、干扰内分泌等[13,14]。

白酒是日常生活中一种不可或缺的饮品，有资料显示2017～2019年中国白酒年产量均大于786万千升[15-17]，随着生活水平的提高，人们对白酒的安全问题也愈发关注，特别是以前容易被忽视的持久性有机污染物（POPs）所带来的威胁。POPs并非在发酵过程中产生，而可能是由酿造过程中所使用的原材料（如含有OPEs的水体、谷物等）、所接触的器具（如塑料的接酒桶、输酒管、乳胶管以及包装材料中的塑料制品等）。

虽然已有研究显示在白酒中检测出邻苯二甲酸酯等塑化剂，但是目前国内外尚无有关白酒中有机磷酸酯分析检测技术的文献报道和标准，这使人们无法了解白酒中OPEs类持久性污染物的主要来源以及污染水平。同时，由于其在白酒中污染水平数据的极度匮乏，相关国家机关部门无法进行有效评估、制定白酒中OPEs持久性污染物含量的合理限值水平。

未来，不排除将OPEs类持久性污染物纳入到我国的标准监管体系中，因此，建立白酒中的OPEs这类持久性有机污染物的分析监测方法，不仅可以监测有机磷酸酯在白酒中的含量水平以及迁移情况，保护人体健康，也有利于规范白酒生产工艺，为企业发展、政府部门监管市场提供技术支撑。

当前，对白酒中有机污染物检测的前处理技术主要有LLE（液液萃取）、SPE（固相萃取）、UAE（超声辅助萃取）、SPME（固相微萃取法）及QuEChERS等[18-21]，而在OPEs的检测方法中，以配有氮磷检测器的气相色谱（GC-NPD）、气相色谱串联质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）为主[22]。相比其他三种提取方式，LLE（液液萃取）具有操作更简便的特点在食品安全领域、环境及生物检测等方面得到广泛应用；在灵敏度方面，GC-MS/MS的反应监测模式较GC-MS更优良，在基质对检测的影响方面，其电子轰击源电离比LC-MS/MS更低，而且它还具有高分辨率、高重现性等特点。综合以上技术方法的优劣，本研究建立了液液萃取结合GC-MS/MS检测白酒中8种OPEs的分析方法，该方法简便、快速、经济。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（7890A-7000D，美国安捷伦），配EI源；HP-5 ms Ultra Inert弹性的石英毛细管柱（30 m×250μm×0.25μm，美国安捷伦）；电子天平[BSA224S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；48位全自动平行浓缩仪（AutoEVA-60，厦门睿科有限公司）；圆周振荡器（IKA）；旋转蒸发仪器（IKA）、低温冷却循环泵（DLSB-5/20,郑州长城科工贸有限公司）。

8 种有机磷酸酯标准品：磷酸三正丁酯（TBP）、磷酸丁氧基乙基酯（TBEP）、磷酸三苯酯（TPP）均购自上海麦克林生化科技有限公司；磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、磷酸三邻甲苯酯（o-TCP）、氘代磷酸三苯酯（TPP-d15）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二苯基-2-乙基己酯（EHDPP）、磷酸三间甲苯酯（m-TCP）、磷酸三对甲苯酯（p-TCP）均购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

正己烷为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；无水硫酸钠、氯化钠、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

有机滤膜（0.45μm，天津市津腾实验设备有限公司）。白酒样品（由福建省产品质量检验研究院提供）。

1.2 标准储备液的配制

准确称取适量TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP标准品于100 mL的容量瓶中，用丙酮配置成浓度为1000μg/mL标准储备液，置4 ℃冰箱保存，使用时再逐级稀释配成所需浓度的标准液。

称取适量的TPP-d15标准品于100 mL容量瓶中，用丙酮配置成浓度为10μg/mL的内标溶液。

1.3 样品前处理

分别取5 g酒样于25 mL的离心管内，加入0.6 g氯化钠，在涡旋振荡器上涡旋1 min，再加入4 mL的纯净水，用5 mL乙酸乙酯进行提取，再在涡旋振荡器上涡旋5 min，然后静置5～10 min。吸取离心管上层乙酸乙酯到另一个10 mL试管中，并再一次用5 mL乙酸乙酯提取，合并2次的乙酸乙酯，加入0.5 g无水硫酸钠后于涡旋振荡器上涡旋1 min，最后在40 ℃的温度下用小气流的氮气吹至1 mL以下，再用乙酸乙酯定容为1.0 mL，加入10μL的内标物（TPP-d15），待进样检测。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：HP-5 ms Ultra Inert（30 m×250μm×0.25 μm）；载气：氦气；进样口温度：250 ℃。

程序升温：初始60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升温到170 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升温到310 ℃并保持5 min；色谱柱流量：1 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。

1.4.2 质谱条件

离子源：电子轰击离子源（EI）；离子源温度：280 ℃；电离能量：70eV；连接线温度：280 ℃；溶剂延迟时间：2.8 min；扫描方式：MRM。主要OPEs的质谱参数及保留时间见表1。

2 结果和讨论

2.1 气相色谱－串联质谱条件的优化

设置成全扫描模式，调节升温程序，实现5μg/mL混合标准品（8种有机磷酸酯化合物、1种氘代有机磷酸酯化合物）中目标物基线的良好分离，通过利用谱库检索功能对8种有机磷酸酯进行辨别和确定，根据已得到的8种有机磷酸酯的保留时间进一步对本实验所需要的色谱条件进行调整和优化。全扫描模式下，将提取到的8种有机磷酸酯所具有的特征性离子作母离子，对母离子分别施加5～30 eV碰撞能量，扫描辨识具有特征性的子离子，依次调整碰撞能以筛选最适合的碰撞能值，最终确定9种有机磷酸酯的最优化的母离子对、子离子对以及最适合的碰撞能量。然后再用多反应监测扫描（MRM) 实现对有机磷酸酯类化合物的准确定量分析。9 种有机磷酸酯的多选择反应监测信息见表1，结果表明在10 min内，9种有机磷酸酯可以全部实现良好的分离。

2.2 提取溶剂的优化

有机磷酸酯的极性范围较大，logKow（辛醇水系数）在1.44～6.64的范围之间（表2）。为实现对样品的快速检测以及确保对目标物有较好的提取效果，本研究采取液液萃取（LLE）的提取方法。

本研究对使用不同极性的正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷等有机溶剂提取白酒中8种有机磷酸酯的效果进行了评估，实验发现按照1.4的方法进行操作，均能够使目标物快速进行提取。图1为3种有机溶剂对8种有机磷酸酯目标物的提取回收率的对比，从图中可以看出，除了正己烷对TCEP的提取回收率较低外，其余2种对TCEP的提取回收率都较高。由于二氯甲烷对人体和环境有害，因此，本实验最终选择乙酸乙酯作为LLE萃取剂。

图1 3种不同溶剂的提取效果

同时，实验表明乙酸乙酯分2次提取相比1次提取可以显著提高有机磷酸酯的回收率，而且使用乙酸乙酯作为萃取溶剂在节省溶剂用量同时还比较环保。

2.3 线性回归方程、检测限和定量限

在优化后的实验条件下，本研究采用TPP-d15为内标物质，以内标法对TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP这8种有机磷酸酯进行定量分析。对浓度为5、10、25、50、100、250、500μg/L的标准液进行测定，以OPEs与TPP-d15的峰面积之比为纵坐标，以两者的浓度之比建立横坐标，进行线性回归分析，并作标准曲线。二者的线性相关系数均大于0.998，检出限是0.031～0.41μg/kg ，定量限是0.10～1.4μg/kg。其中，目标化合物的峰高为噪声3倍（S/N=3）时所对应的浓度是检测限，为噪声10倍（S/N=10）对应的浓度是定量限。表3是所测8种有机磷酸酯的标准曲线方程、方法检测限和定量限及相关系数。

表3 8种OPEs的标准曲线方程及其相关系数、方法检出限和定量限

2.4 精密度、准确度和回收率

本研究中，在空白白酒样品分别添加2.0、5.0、10.0μg/kg的3个浓度水平进行加标回收试验，对每个浓度水平的平行试验都进行6次，按前述1.4的操作方法进行实验处理，表4为试验结果。表4可知，白酒中8种有机磷酸酯的回收率和相对标准偏差分别在77.2%～96.8%和3.1%～8.9%之间，说明本实验建立起的白酒中8种有机磷酸酯的检测方法的准确性和稳定性都较高，可以对实际白酒样品进行检测。图2为空白白酒中添加量为10μg/kg的总离子流图。

表4 白酒中8种OPEs的回收率、相对标准偏差（n=6）

图2 白酒中添加量为10μg/kg的总离子流图

2.5 实际样品的检测

采用本方法对市场上的20份白酒样品进行8种有机磷酸酯的检测分析，结果显示有机磷酸酯均未在样品中检出。

3 结论

本研究建立了液液萃取结合气相色谱法－三重四极杆质谱对白酒中的8种有机磷酸酯化合物（TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP）进行快速检测的分析方法，优化了方法的提取方式、萃取溶剂等检测条件，采取内标（TPPd15）进行定量分析，减少了基质的干扰。通过对方法学评价的结果进行分析，可以了解到本研究所建立的检测方法的准确度和精密度都较高，TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP的加标回收率在77.2%～96.8%之间，相对标准偏差为3.1%～8.9%，方法检测限检出限为0.031～0.41 μg/kg，定量限为0.10～1.4μg/kg。本实验方法在前处理过程中操作步骤简便、快速，同时质谱仪器分析的时间仅需10 min，适用于白酒样品中有机磷酸酯类有机污染物的快速、准确检测。