血清过氧化氢酶活度臧红T 荧光猝灭检测方法的建立及优化

张爱菊，白莹，薛林科，戴兴德，张小林，董娜

甘肃医学院药学系，甘肃 平凉 744000

过氧化氢酶（catalase，CAT）广泛存在于人体内［1-4］，CAT 活度是与抗肿瘤及抗衰老密切相关的酶学指标，已纳入临床常规检测。CAT 活度测定方法有紫外-可见光度法、滴定法等［5-7］，近年研发的显色光度法和褪色光度法备受关注［8-12］，其中显色光度法的显色剂溶液需现用现配，难以满足临床快速检验要求；褪色光度法的准确度相对较低。因此，亟需研发一种高效、快速、实用的新方法。

荧光检测法具有背景信号小、灵敏度及准确度高等优点，已应用于活度分析［13-14］。基于Fenton 试剂（H2O2／Fe2+）作用下的荧光试剂臧红 T（safranine T，ST）在 575 nm 发射波长处有最大荧光峰［15-19］，本研究利用CAT 对H2O2氧化ST 反应具有抑制作用的原理，建立测定CAT 活度的荧光猝灭法，该方法分为酶促反应和荧光猝灭反应2个阶段，并对方法中的酶促反应和荧光猝灭反应条件进行优化，以期将建立的方法应用于CAT 活度的临床快速检测。

1 材料与方法

1.1 血清 人血清样品（共6 份，编号1 ～6，性别分别为男、女、男、女、男、女，年龄分别为 8、8、38、38、69、69岁）由甘肃医学院附属医院体检中心提供。

1.2 主要试剂及仪器 30%的双氧水（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；CAT 固体（生物试剂，标示量 ≥ 3 000 U ／ mg）购自如吉生物科技发展有限公司；ST 固体（生物试剂）购自天津市大茂化学试剂厂；FeSO·47 H2O 固体（分析纯）购自福晨化学试剂有限公司；930N 荧光分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司。

1.3 溶液配制 H2O2底液：用蒸馏水将0.50 mL 30%的双氧水稀释至250 mL，高锰酸钾法测定其浓度，根据测定值稀释至 1 mmol ／ L（即 1 μmol ／ mL）；CAT 标准溶液：称取CAT 固体5 mg，蒸馏水定容至100 mL，高锰酸钾法测定其活度，根据测定结果稀释为 1 U ／ mL；ST 溶液：称取 0.701 6 g ST 固体，蒸馏水定容至 1 000 mL，即浓度为 2 mmol ／ L；Fe2+溶液：称取0.695 0 g FeSO·47 H2O 固体，用蒸馏水溶定容至250 mL，即浓度为 0.01 mol ／ L。

1.4 方法的建立 取人体血清25 ～100 μL，置50 mL容量瓶中，加入H2O2底液，30 ℃恒温反应；立即加入催化剂和ST，室温反应后定容。以ST 空白作参比，在1 cm 吸收池中测定575 nm 发射波长处荧光强度F，同步测定酶空白体系F（0在H2O2之前加入Fe2+完成酶失活，其他方法同上），CAT 活度E 由△F（F - F0）、标准曲线方程、样品稀释倍数计算确定。用 μmol ／ mL（U ／ mL）表示酶活度，即 1 mL 酶液所能分解过氧化氢物质的量（μmol）。

1.5 荧光猝灭反应条件优化

1.5.1 催化剂的确定 取4个50 mL 容量瓶，分别加入 ST、H2O2+ST、H2O2+ST+Fe3+、H2O2+ST+Fe2+，其中 ST 为 3.00 mL，H2O2为 1.00 mL，Fe3+和 Fe2+均为0.80 mL，室温反应15 min，蒸馏水定容，按1.4项方法测定F。

1.5.2 催化剂用量的确定 取7个50 mL 容量瓶，均加入1.00 mL H2O2及3.00 mL 的ST，再分别加入0.00 ～ 1.20 mL 的 Fe2+溶液，室温反应 15 min，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定F。

1.5.3 ST 用量的确定 取7个50 mL 容量瓶，分别加入0 ～6 mL 的ST，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定F。

1.5.4 硫酸用量的确定 取6个50 mL 容量瓶，均加入 1.00 mL H2O2、0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，分别加入0 ～1 mL 的硫酸，室温反应15 min，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定F。同时设ST 对照（仅加ST，不加 H2O2和 Fe2+）。

1.5.5 荧光猝灭时间的确定 取12个50 mL 容量瓶，均加入 1.00 mL H2O2、0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，于室温分别反应 0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 min，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定F。

1.6 酶促反应条件的优化

1.6.1 反应底物H2O2用量的确定 取11个50 mL容量瓶，分别加入 0.00、0.25、0.05、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50、3.00 mL 的 H2O2，再加入0.80 mL Fe2+和 3.00 mL ST，室温反应 15 min，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定F。

1.6.2 酶促反应时间的确定 取7个50 mL 容量瓶，均加入1.00 mL CAT 标准溶液及1.00 mL 的H2O2底液，室温分别反应0 ～30 min，蒸馏水定容，按1.4 项方法测定△F。

1.7 方法的验证

1.7.1 标准曲线的建立 取CAT 标准溶液0、125、250、375、500、750、1 000 μL，按 1.4 项方法测定 F，计算△F 和 CAT 活度，以 CAT 活度（U ／ mL）为横坐标，△F 为纵坐标，绘制标准曲线；平行测定酶空白10次，计算标准偏差，标准曲线斜率除以3 倍的标准偏差获得检测限。

1.7.2 干扰试验 取1.00 mL CAT 标准溶液，置50 mL容量瓶，按1.4 项方法检测酶活度；另取1.00 mL CAT标准溶液，加入浓度小于H2O2底液1 ／ 2 的共存还原性物质（1 mmol ／ L Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖各0.5 mL），按1.4 项方法检测酶活度。

1.7.3 准确性 取编号1 ～3 的人血清样品，分别加入终浓度 5.0 U ／ mL 的 CAT 标准溶液；取编号 4 ～ 6的人血清样品，分别加入终浓度10.0 U ／ mL 的CAT标准溶液。按建立的方法检测CAT 活度，每份样品检测6次，并按下式计算回收率。

回收率（%）=（加标样品检测值-未加标样品检测值）／加标样品检测值× 100%

2 结 果

2.1 荧光猝灭条件的优化

2.1.1 最佳催化剂 在ST 基础上单纯加入H2O2，反应不明显，荧光强度下降幅度仅为5%；Fe3+对H2O2氧化ST 无催化作用，荧光强度保持不变；加入Fe2+后，ST 荧光猝灭，猝灭率达70%。见图1。表明Fe2+可有效降低H2O2的分解活化能，产生更具氧化功能的羟自由基。因此选择Fe2+作为催化剂。

图1 催化剂的优化结果Fig.1 Optimization of catalyzer

2.1.2 最佳Fe2+用量 Fe2+溶液体积为0.00 mL时，ST 与 H2O2几乎不反应；Fe2+溶液体积在 0.10 ～0.80 mL 范围内时，荧光猝灭反应程度直接取决于Fe2+用量；Fe2+溶液体积 ＞ 0.80 mL 时，高浓度 Fe2+将促使H2O2分解，荧光猝灭反应受抑制。见图2。因此，确定催化剂Fe2+的最佳用量为0.80 mL。

图2 Fe2+用量的优化结果Fig.2 Optimization of dosage of Fe2+

2.1.3 最佳ST 用量 随着ST 体积的增加，F 逐渐升高，2 mmol ／ L ST 溶液在 0.00 ～ 3.00 mL 范围内与荧光强度呈线性关系，见图3。因此确定ST 最佳体积为为3.00 mL。

图3 ST 用量的优化结果Fig.3 Optimization of dosage of ST

2.1.4 最佳硫酸用量 随着硫酸加入体积的增大，高酸度使ST 质子化效应增强，荧光强度减弱；ST 猝灭反应体系受H2SO4影响较小，荧光强度基本保持恒定。即H2SO4取0.00 mL 时，ST 对照溶液的pH为4.82，ST 猝灭反应体系的pH 为4.11，相对荧光强度变化量达最大。见图4。因此，确定荧光猝灭反应不需加入硫酸（pH 范围为4.11 ～4.82）。

图4 硫酸用量的优化结果Fig.4 Optimization of dosage of sulfuric acid

2.1.5 最佳荧光猝灭时间 随着荧光猝灭时间的延长，F 快速下降。猝灭时间在2.5 ～10 min 内，与F 呈线性关系，15 min 后F 降至最低并趋于恒定，60 min 内F 保持不变。见图5。因此，确定最佳猝灭时间为15 min。

图5 荧光猝灭反应时间的优化结果Fig.5 Optimization of time for fluorescence quenching

2.2 酶促反应条件优化

2.2.1 反应底物H2O2的最佳用量 随着H2O2加入量的增加，F 逐渐降低。H2O2加入量在0.00 ～1.00 mL 范围内时，其体积与F 呈良好的线性关系；H2O2加入量＞1.50 mL 时，荧光猝灭程度降低。见图6。因此，确定H2O2溶液的最佳用量为1.00 mL。

图6 底液H2O2 用量的优化结果Fig.6 Optimization of consumption of H2O2

2.2.2 最佳酶促反应时间 酶促时间在0 ～5 min内与△F 成线性；延长至10 min 后，△F 趋于恒定。见图7。因此确定酶促反应时间为10 min。

图7 酶促反应时间的优化结果Fig.7 Optimization of time for enzymatic reaction

2.3 方法的验证

2.3.1 线性范围 CAT 活度的标准曲线见图8。CAT 活度在 5 × 10-5～ 0.02 U ／ mL 范围内，与△F 呈良好的线性关系，线性方程为y=180 7 x + 0.752 7，r = 0.998 0，检测限为 3.81 × 10-5U ／ mL。

图8 CAT 活度的标准曲线Fig.8 Standard curve for determination of catalase activity

2.3.2 干扰试验 未加干扰物质时，CAT 活度为0.02 U ／ mL；当反应液中存在 1 × 10-5mol ／ L 的 Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖时，CAT 活度分别为0.020 5、0.020 2、0.020 6、0.020 1、0.020 3 U ／mL，测定误差＜5%。

2.3.3 准确性 6 份血清加标样品的检测值在40.7 ～ 69.7 U ／ mL 范围内，加标回收率为 98.0% ～102.0%，均在95% ～105%范围内，见表1。表明该方法具有良好的准确性。

表1 准确性验证结果Tab.1 Verification for accuracy

3 讨 论

ST 是一种水溶性偶氮染料，带黄红色荧光，具有一定的还原性。H2O2具有一定的氧化能力，在Fe2+的作用下，形成更具氧化性的羟基自由基，使ST 荧光猝灭，猝灭程度取决于H2O2的含量；CAT 是H2O2的专用分解酶，CAT 使荧光猝灭受抑制，因此加CAT 前后荧光变化可表明CAT 活度。

本研究建立了血清CAT 活度的ST 荧光猝灭检测法，并对ST 荧光猝灭反应和酶促反应条件进行了优化，结果表明，最佳催化剂为Fe2+，用量为0.80 mL；ST 用量为 3.00 mL；荧光猝灭反应 pH 范围为4.11 ～4.82，不需加入硫酸；猝灭时间为15 min；H2O2溶液用量为1.00 mL；酶促反应时间为10 min。两个反应环境适应性强，反应快速，测定过程更为简化。同时，对建立的方法进行了验证，结果表明，CAT活度在 5 × 10-5～ 0.02 U ／ mL 范围内，与△F 呈良好的线性关系，线性方程为y = 180 7 x + 0.752 7，r = 0.998 0，检测限为 3.81 × 10-5U ／ mL；检测体系液中存在 1 × 10-5mol ／ L 的 Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖时测定误差为＜5%，由于人体血清样品每次取样约50 μL，即样品中上述干扰物的浓度控制在10 mmol ／ L 以内时，不影响酶活度测定；6 份血清加标样品的回收率均在95% ～105%范围内，与文献［20］结果一致，并发现正常人血清CAT 活度与年龄相关，儿童及老年人血清中的CAT 活度较高，由于检测样品数量较少，该结论有待进一步验证。

综上所述，本研究建立的方法具有良好的准确性，检测限更低，进一步克服了血清样品共存还原性物质的干扰，且操作程序简便，可直接用于人体血清CAT 活度分析，用于临床疾病诊断，具有广阔的应用前景。今后，将进行大范围血清样品的CAT 活度分析，包括正常人、临床患者等，针对性别、年龄及患者疾病类型进行系统分析，进一步探讨CAT 活性与患者疾病间的相关性；另外，还将对方法的实验条件和试剂用量等进行进一步优化，为研发低成本、实用性好的血清荧光试剂盒奠定基础。