AA-PR8 冷适应流感病毒疫苗株的制备及质量评价

郭航炜，徐康维，李星星，周瑞雪，谢莹，权娅茹，赵慧，李长贵

1.中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室，北京 102629；2.山西省食品药品检验所，山西 太原 030031

预防流感最有效的手段为疫苗接种。疫苗接种不仅可降低高危人群的发病率和死亡率，也可减轻症状，降低并发症的发生，减少流感病毒在人群中的传播［1-3］。目前主要有全病毒流感灭活疫苗、裂解流感疫苗、亚单位疫苗、流感减毒活疫苗及重组蛋白疫苗等［4-7］。其中流感减毒活疫苗采用鼻腔接种，类似自然感染过程，不仅可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，还可激发黏膜免疫，并避免了肌肉注射的种种不便，提高了接种的依从性［8-11］。

流感病毒表面抗原HA、NA 易发生突变，为应对这种突变，WHO 在全球设立流感监测网络实验室，根据每年病毒流行情况预测并推荐流感疫苗生产用疫苗株［1，5］。疫苗株通常由重配技术制备，近年来，反向遗传技术也用于疫苗株制备，其中8 质粒系统应用最为广泛［12-13］。本研究采用8 质粒反向遗传技术，以冷适应 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）流感病毒作为供体株，制备了含 A ／Puerto Rico／8 ／34（H1N1）HA、NA 表面抗原的AA-PR8 冷适应流感病毒疫苗株，并对该疫苗株进行了质量评价。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及载体 E.coli DH5α 感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。293T 细胞由中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室保存；MTY6 细胞由该室构建，是一种能够稳定表达牛胰蛋白酶原的MDCK 细胞系；A ／Puerto Rico ／8 ／34（H1N1）病毒（简称PR8 野病毒）、双向表达载体pHW2000 由该室保存。

1.2 实验动物 9 ～11 日龄SPF 鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；SPF 级BALB ／ c小鼠，雌性，4 ～ 6 周龄，体重 13 ～ 15 g，由中国食品药品检定研究院提供，在ABLS-2 实验室进行实验操作。动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0017；动物使用许可证号：SYXK（京）-2017-0013；实验动物福利伦理审查批复号：中检动（福）第 2022（B）004 号。

1.3 主要试剂 DMEM 培养基、Opti-MEM 减血清培养基、胎牛血清、双抗（青霉素-链霉素）、HEPES、胰酶购自美国Gibco 公司；BsmBⅠ限制内切酶购自美国 NEB 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 病毒 RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR 纯化试剂盒、质粒中提试剂盒购自德国QIAGEN 公司；SuperScript®ⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒、Lipo3000 转染试剂盒、Agarose 琼脂糖、LB 肉汤基础培养基、Leibovitz′s L-15 培养基购自美国 Invitrogen公司；PrimeSTAR®Max DNA 聚合酶、In-Fusion 无缝克隆试剂盒、DNA marker、RNase-free Water 购自日本TaKaRa 公司。

1.4 重组质粒的构建

1.4.1 冷适应骨架质粒构建 在NCBI 数据库中下载 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷适应株的 PB2（KT383437.1）、PB1（KT383438.1）、PA（KT383439.1）、NP（KT383440.1）、M（KT383441.1）及 NS（KT383442.1）6个基因序列，在序列5′端添加CGTCTCCGGGA，3′端添加AATAGGAGACG。序列委托安升达公司合成。采用In-Fusion 无缝克隆试剂盒连接至经BsmBⅠ酶切线性化的PHW2000 载体上，转化并进行克隆培养。提取质粒，送安升达公司测序。序列正确的质粒命名为PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AAPB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AA-NP、PHW2000-AA-M 和 PHW2000-AA-NS。

1.4.2 PHW2000-PR8-HA、PHW2000-PR8-NA 质粒的构建 用QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取 PR8RNA，SuperScript®ⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒及通用引物（5′-AGCAAAAGCAGG-3′）逆转录合成 cDNA，以其为模板，利用PR8-HA ／NA 引物（见表 1）和Prime STAR®Max DNA聚合酶 PCR 扩增 PR8-HA 和 PR8-NA 基因片段。PCR 反应条件：98 ℃变性 5 min；98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共 35个循环；72 ℃ 5 min。用 In-Fusion 无缝克隆试剂盒连接至PHW2000 载体上，转化并进行克隆培养。提取质粒并送安升达公司测序。序列正确的质粒命名为PHW2000-PR8-HA 和PHW2000-PR8-NA。

1.5 细胞转染及病毒拯救 将293T 细胞稀释至约1 × 106个 ／mL，MTY6 细胞稀释至约 1 × 105个 ／mL，等体积混合后，接种 6 孔板，2 mL ／ 孔，37 ℃，5% CO2培养箱培养约24 h 至细胞长满板底；将PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AA-PB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AA-NP、PHW2000-AA-M、PHW2000-AANS、PHW2000-PR8-HA 和 PHW2000-PR8-NA 共 8个质粒各500 ng 混匀，按Lipo3000 转染试剂盒说明书转染24 h；更换为不含胎牛血清的DMEM 培养基并转移至33 ℃，5%CO2培养箱继续培养6 h；加入终浓度为1 μg ／mL 的TPCK-胰酶消化细胞。转染后培养72 h 冻融2 次后，取细胞悬液接种鸡胚（200 μL ／枚），33 ℃孵箱培养72 h；取尿囊液进行血凝试验，验证是否重配出病毒。提取血凝试验阳性的尿囊液总RNA，按照 1.4.2 项方法，利用引物（见表 1）进行PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，连接至PHW2000 载体后进行测序。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.6 病毒的克隆化培养 将测序正确的重配流感病毒尿囊液经10 倍系列稀释后接种鸡胚，每个稀释度接种6 枚，33 ℃培养48 h 后收获尿囊液，检测HA滴度。选择最高稀释度HA 阳性鸡胚的尿囊液，得到克隆化培养产物，重复进行1 次克隆化培养，将第2 次克隆化培养尿囊液稀释106倍后接种10 枚鸡胚，33 ℃培养48 h 后收获尿囊液，混合后分装，得到AA-PR8 冷适应流感病毒疫苗株（简称AA-PR8 疫苗株）。

1.7 遗传稳定性评价 将AA-PR8 疫苗株稀释10 000倍后接种鸡胚，200 μL ／ 枚，传代 5 次，1 ～ 5 代分别记为 E1、E2、E3、E4 和 E5。检测各代次血凝效价和病毒滴度（采用鸡胚法：将尿囊液系列稀释后接种鸡胚，33 ℃培养48 h；取尿囊液进行血凝试验，Reed-Muench 公式计算鸡胚半数感染剂量，即EID50）。按1.4.2 项方法对E1 和E5 代全部基因进行测序，检测8个基因氨基酸序列有无突变，以及冷适应相关位点是否发生改变。

1.8 温度敏感性及冷适应表型评价 将AA-PR8 疫苗株进行10 倍系列稀释后接种鸡胚，每个稀释度接种 18 枚，各取 6 枚分别在 26、33 和 39 ℃条件下培养48 h 后，取尿囊液进行血凝试验，并检测病毒滴度。以PB8 野病毒作为对照。

1.9 小鼠中减毒特性评价 将BALB／c 小鼠用异氟烷麻醉，左右 2个鼻孔各滴入 25 μL 104、105、106EID50／50 μL 3个免疫剂量的 AA-PR8 疫苗株或 PR8 野病毒进行攻毒，以PBS 作为阴性对照，每组6 只小鼠。每日观察小鼠体重变化及死亡情况，共观察14 d。以106EID50／ 50 μL 剂量对 10 只小鼠进行攻毒，在感染后第3 和6 天各处死5 只小鼠，取右侧肺脏称重后，加入9 倍肺脏体积的Leibovitz′sL-15 培养基匀浆后，检测病毒滴度（方法同1.7 项）。

1.10 季节性流感病毒冷适应疫苗株的制备及温度敏感性、冷适应表型评价 采用上述方法，从GISAID数据库中下载2020 — 2021 北半球流行毒株A ／Hawaii ／ 70 ／ 2019（H1N1）、A ／ Hong Kong ／ 45 ／ 2019（H3N2）以及 2021 — 2022 北半球流行毒株 A ／ Wisconsin ／ 588 ／ 2019（H1N1）、A ／ Cambodia ／ e0826360 ／2020（H3N2）的 HA、NA 基因序列并进行合成，制备冷适应疫苗株。对制备得到的疫苗株温度敏感性和冷适应表型进行评价。

1.11 统计学分析 使用GraphPad Prism 8 和Excel 2010 软件绘图并进行数据分析，组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 质粒鉴定及病毒拯救 质粒PHW2000-AA-PB2、PHW2000-AA-PB1、PHW2000-AA-PA、PHW2000-AANP、PHW2000-AA-M、PHW2000-AA-NS、PHW2000-PR8-HA 和PHW2000-PR8-NA 经测序证明构建正确。8个质粒等比转染MDCK ／ 293T 混合细胞，接种SPF 鸡胚，33 ℃培养72 h 后，尿囊液血凝效价为512，表明病毒拯救成功。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，8个基因片段大小均与预期一致，见图1。扩增片段连接至PHW2000 载体进行测序，PB2、PB1、PA、NP、M 及 NS 基因序列均与 A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷适应株一致，HA 及NA 基因序列均与PR8野病毒一致。

图1 AA-PR8 疫苗株目的基因PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of target genes of AA-PR8 vaccine strain

2.2 病毒的克隆 第1 次克隆化培养时，尿囊液稀释108倍后，6 枚鸡胚中2 枚血凝试验阳性，收获该稀释度其中1 枚鸡胚的尿囊液进行第2 次克隆化培养，稀释108倍后，6 枚鸡胚中1 枚血凝试验阳性，收获该稀释度其中1 枚鸡胚的尿囊液，稀释106倍后接种10 枚鸡胚进行扩大培养，收获的尿囊液血凝效价为256，混合后分装，得到AA-PR8 疫苗株。

2.3 遗传稳定性 E1 ～E5 代AA-PR8 疫苗株血凝效价分别为 256、128、256、512、384，病毒滴度分别为 8.10、8.06、8.45、8.54、8.39 lgEID50／ mL，均较为稳定。E1 和E5 代基因测序结果显示，PB2 核苷酸序列有 3个突变：G963A、A1194G、C1933T；PA 核苷酸序列有1个突变：G75T；NP 核苷酸序列有2个突变：C627A、G909C，其余位点未发生突变。上述突变均为同义突变，8个基因的氨基酸序列均未发生改变。

2.4 温度敏感性及冷适应表型 AA-PR8 疫苗株在33 ℃培养时滴度为 8.10 lgEID50／ mL，39 ℃培养时滴度为0，而PR8 野病毒在2个温度培养时滴度接近，表明AA-PR8 疫苗株具有温度敏感性。在26 ℃培养时，AA-PR8 疫苗株滴度为 4.45 lgEID50／ mL，PR8 野病毒滴度为0，表明AA-PR8 能够在低温下生长，具有冷适应表型。见表2。

2.5 AA-PR8 疫苗株在小鼠中的减毒特性

2.5.1 感染后小鼠体重变化及死亡情况 PB8 野病毒感染后，小鼠体重降低，3个感染剂量组小鼠均在第6 天达到体重最低值，且体重降低程度与感染病毒剂量呈正相关；104、105、106EID50剂量组小鼠在感染后第6 天，平均体重分别降低了13.6%、18.8%和25.1%。而AA-PR8 疫苗株感染后，小鼠体重降低幅度较少；104、105、106EID50剂量组小鼠在感染后第6 天，平均体重分别降低了0.7%、1.6%和5.2%。PBS 对照组小鼠体重持续增长。PB8 野病毒106EID50剂量组小鼠感染后第6 和7 天各死亡1 只，其余各组小鼠均健存。见图2。

图2 AA-PR8 疫苗株和PB8 野病毒感染后小鼠体重变化（A）及存活情况（B）Fig.2 Bodyweight change（A）and survival（B）of mice infected with AA-PR8 vaccine strainand PR8 wild virus

2.5.2 感染后小鼠肺脏病毒载量 AA-PR8 疫苗株和PR8 野病毒感染后第3 天，小鼠肺脏病毒载量平均值分别为 1.95 和 5.78 lgEID50／ mL，AA-PR8 疫苗株病毒载量较PR8 野病毒降低6 760 倍（t=34.54，P ＜ 0.000 1）；感染后第 6 天，病毒载量平均值分别为 1.43 和 4.82 lgEID50／ mL，AA-PR8 疫苗株病毒载量较 PR8 野病毒降低 2 455 倍（t = 34.69，P ＜0.000 1）。见图 3。

图3 感染后小鼠肺脏病毒载量Fig.3 Viral load in lung of mice after infection

2.6 季节性流感病毒冷适应疫苗株的温度敏感性及冷适应表型 成功制备了2020—2021 及2021—2022年度北半球流行的4 株甲型流感病毒冷适应疫苗株 AA-A ／ Hawaii ／ 70 ／ 2019（H1N1）、AA-A ／Hong Kong ／ 45 ／ 2019（H3N2）、AA-A ／ Wisconsin ／588 ／ 2019（H1N1）和 AA-A ／ Cambodia ／ e0826360 ／2020（H3N2），均具有温度敏感性和冷适应表型，见表2。

表2 温度敏感性及冷适应表型检测结果Tab.2 Test results of temperature sensitivity and cold-adapted phenotype

3 讨 论

冷适应流感减毒活疫苗能够有效激发细胞免疫及黏膜免疫，产生更为广泛的免疫反应，具有应对流感病毒抗原变异的潜在优势［10-11］。冷适应流感减毒株能够在人体鼻腔较低温度下正常生长，而在下呼吸道39 ℃体温条件下不能复制。因此，接种冷适应流感减毒活疫苗后，病毒仅在鼻腔等上呼吸道黏膜局部复制，并激发免疫反应，而不能进入肺脏生长。该疫苗在美国和俄罗斯已使用多年，我国长春百克生物科技股份公司生产的流感减毒活疫苗也已获批上市。

本研究采用8 质粒反向遗传技术，合成A ／ Ann Arbor ／ 6 ／ 60（H2N2）冷适应流感病毒 PB2、PB1、PA、NP、M 及 NS 6个基因作为骨架，与 PR8 病毒 HA、NA 基因共同进行病毒拯救，经鸡胚克隆培养2 次，成功制备了AA-PR8 冷适应流感病毒疫苗株。将该病毒在鸡胚中进行5 次传代，所有基因氨基酸位点未发生突变，具有良好的遗传稳定性。与PR8 野病毒相比，AA-PR8 疫苗株能在26 ℃条件下生长，不能在39 ℃条件下生长，表明该病毒具有温度敏感性及冷适应表型。本研究还对AA-PR8 疫苗株在小鼠中的减毒特征进行了评价，与接种同等剂量的PR8 野病毒的小鼠相比，接种AA-PR8 疫苗株的小鼠体重降低幅度明显减小，未发生动物死亡；肺部病毒载量降低1 000 倍以上。上述结果表明，AA-PR8 疫苗株降低了对小鼠的致病性，其免疫原性和保护效果仍需要进一步研究。采用该方法，本研究还制备了2020—2021 及2021—2022年度北半球流行的4株甲型流感病毒冷适应疫苗株，初步建立了流感病毒冷适应疫苗株制备及评价平台。