牛蒡苷元对小鼠断尾出血时间和血栓形成的影响*

潘彩燕，林晓坚，袁兆伟，张蓉，刘刚，谢娟

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省人民医院 药剂科，贵州 贵阳 550002；3.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

牛蒡子(ArctiumlappaL)为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实，是中医常用的一味中药[1]。牛蒡苷元(Arc-G)为木脂素类化合物，是牛蒡子中一类主要的活性物质。研究表明，Arc-G具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗心律失常、扩张血管及降低血糖等药理作用[2-13]，还具有抗血小板活化因子的作用[14]，但关于Arc-G抗血栓作用的报道较少。因此，本实验通过观察Arc-G对正常小鼠血液成分和断尾出血时间的影响，同时采用角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓形成及凝血酶诱导体外血栓形成、观察Arc-G对血栓形成的影响，探讨Arc-G的抗血栓作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物 清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量为18～22 g，贵州医科大学实验动物中心提供[合格证号SCXK(黔)2018-0001]。

1.1.2药品与试剂 Arc-G(麦克林试剂公司，批号18092808)，角叉菜胶(Sigma，批号CBG5890V)，凝血酶(Sigma公司, 批号LBV2136)，纤维蛋白原(Sigma公司, 批号SLBS4238)，司匹林肠溶片(大同市利群药业有限责任公司，批号170605)。

1.1.3仪器 XS205型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多科学仪器公司)，HK-UP-20分析型超纯水机(合肥宏科科技有限公司)，全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，RAC-1830全自动凝血分析仪(美国Rayto公司)。

1.2 实验方法

1.2.1小鼠断尾出血时间[15]取32只昆明小鼠，随机均分为空白对照组(生理盐水)、阿司匹林组(100 mg/kg)、Arc-G低剂量组(12.5 mg/kg)和Arc-G高剂量组(50 mg/kg)，按给药体积0.1 mL/10 g腹腔注射给药，1次/d、连续7 d；末次给药30 min时，在距离小鼠尾尖4 mm处剪断，用滤纸吸取第1滴血，立即将小鼠尾巴垂直置于37 ℃ 生理盐水中，记录小鼠尾巴出血时间；血流停止后继续观察1 min，如果1 min内停止流血，则把血流停止时刻记为停止时间；若停止流血后1 min 内又复流，则继续记录，直到15 min还未停止，则出血时间记为15 min。

1.2.2血小板计数及血小板平均体积检测 取32只昆明小鼠，分组给药同1.2.1；末次给药30 min时，下腔静脉取血，肝素抗凝，全自动血液细胞分析仪对血小板数目和血小板平均体积(MPV)进行分析。

1.2.3凝血4项检测 取32只昆明小鼠，分组给药同1.2.2；末次给药30 min时，下腔静脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，全自动凝血仪检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。

1.2.4小鼠尾部血栓模型的制备[16]取40只昆明小鼠，分组给药同1.2.1。末次给药30 min时，各组小鼠均腹腔注射角叉菜胶溶液(20 mg/kg)造模，正常饮食，24 h时用游标卡尺测量小鼠尾巴长度及黑尾长度，黑尾比率(%)=黑尾长度/鼠尾总长度×100%，以黑尾比率表示血栓形成率。

1.2.5斑块回缩实验[17]取10只25～30 g的健康昆明种小鼠，4%水合氯醛麻醉，下腔静脉取血制备小鼠洗涤血小板，加入适量PPP重悬血小板，调整数目至2×1011个/L，室温静置1 h。取3 mL 洗涤血小板分装到2 mL离心管中，500 μL/管，分为空白对照组(生理盐水5 μL)、模型组(生理盐水5 μL)、替罗非班组(替罗非班5 μL，终浓度为0.5 mg/L)、溶剂对照组(5%DMSO 5 μL)、Arc-G低剂量组(终浓度为3.125 μmol/L)及Arc-G高剂量组(终浓度为12.5 μmol/L)，各管分别加入CaCl25 μL(终浓度为1 mmol/L)、纤维蛋白原 10 μL(20 g/L)，轻柔混匀，除空白对照组外，各管分别加入凝血酶 5 μL(终浓度为20 000 U/L)，轻柔混匀，置于37 ℃水浴锅内反应，并在 30 min 时观察并拍照。用Image J软件计算血块回缩的面积、血块回缩比率[血块回缩比率(%)=(血块面积/血块回缩前面积)×100%]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 断尾出血时间

与空白对照组比较，阿司匹林组和Arc-G高剂量组可以显著延长小鼠断尾出血时间，差异有统计学意义(P<0.01)；Arc-G低剂量组也使小鼠的平均出血时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与模型组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 血小板计数及血小板平均体积

连续腹腔注射Arc-G和阿司匹林7 d，与空白对照组比较，各组小鼠血小板数目、MPV比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 Arc-G对小鼠血小板计数和MPV的影响

2.3 PT、APTT、TT及FIB

与空白对照组比较，阿司匹林组显著延长小鼠APTT，差异有统计学意义(P<0.05)，但对PT、TT、FIB的影响差异无统计学意义(P>0.05)，Arc-G对小鼠PT、APTT、TT及FIB差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 Arc-G对小鼠PT、APTT、TT及FIB的影响

2.4 静脉血栓

与空白对照组相比较，Arc-G高剂量组可显著减少由角叉菜胶引起的小鼠尾部血栓形成率(P<0.05)；低剂量也可减少小鼠黑尾比率，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：(1)与模型组比较，P<0.01。

2.5 体外血栓及血块回缩实验

与空白对照组比较，Arc-G低剂量、Arc-G高剂量或替罗非班均可明显抑制血块回缩，且高剂量Arc-G比低剂量Arc-G效果更佳(图3)；与溶剂对照组比较，Arc-G低剂量、Arc-G高剂量可抑制血块回缩(P<0.05，表3)。

图3 Arc-G对斑块回缩实验的影响

表3 Arc-G对血块回缩比率的影响

3 讨论

血小板数目、血小板功能及凝血系统是影响止血功能的主要因素。本研究建立小鼠断尾出血时间测定模型观察Arc-G对小鼠止血功能的影响，间接评价Arc-G对血小板功能的作用。本实验测定小鼠断尾出血时间结果提示，Arc-G和阿司匹林均能显著延长小鼠的尾巴出血时间；血液学分析结果提示，Arc-G对血小板数目、MPV的影响差异无统计学意义(P>0.05)；另外，血液凝血4项的测定结果提示，Arc-G对PT、APTT、FIB、TT的影响差异无统计学意义(P>0.05)；因此，Arc-G可能是通过影响血小板功能延长小鼠的止血时间。

角叉菜胶是从红藻类海草中提取出来的硫酸多糖，能够诱导机体释放出白介素-1、肿瘤坏死因子等炎症物质[18]，引起炎症反应发生。这些炎症介质可对正常内皮细胞造成损伤，导致炎细胞趋化、浸润，使凝血系统被激活，从而影响血小板活化、凝血系统等相关蛋白质的表达，可诱导小鼠尾部形成血栓。角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型成功率高，操作简单，易于重复，对小鼠损伤较小，且易于观察和测量[19]，该模型已广泛应用于评价功能性食品的抗血栓作用。血栓的形成过程复杂，与血小板的活性、血管内皮损伤等因素有关[20]。其中，血小板在血栓形成过程中起关键作用。血块回缩是由于凝血酶激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成稳定凝块，反映了血小板在体外形成稳固血栓的过程。本实验结果表明，Arc-G(50 mg/kg)可以显著减少角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓的形成，能够抑制凝血酶诱导的血块回缩。

综上所述，Arc-G延长小鼠尾巴出血时间可能与其能够影响血小板功能有关，Arc-G可能是通过影响血小板功能发挥抑制血栓形成的作用。本研究只是初步考察了Arc-G抗血栓的作用，其发挥抗血栓作用的机制还有待进一步的研究。