卡瓦胡椒素B对人胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及机制*

李悦，崔冬冰，郑迪杰，王秀红*

(1.贵州医科大学 护理学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学附属医院 肝胆外科，贵州 贵阳 550004)

胰腺癌是目前公认的恶性程度极高的肿瘤之一，死亡率高、预后极差，患者生存率低于7%[1-2]。目前，临床上治疗胰腺癌主要采用手术切除及化、放疗和其它局部对症治疗，治疗效果十分有限[3]，所以亟需研发新的治疗方法提高患者生存率。使用药物抑制癌症的发生和发展，被认为是治疗肿瘤的有效方法之一[4]。天然产物是具有生物活性的天然来源化合物，近几十年来开发的抗癌药物有50%源自天然产物提取物发展而来，具有广阔的发展前景[5-7]。有研究表明天然产物能够通过调控自噬、诱导铁死亡从而发挥抗肿瘤活性作用[8-9]。卡瓦胡椒素(flavokawain B, FKB)是从太平洋岛屿灌木丛中提取的一种天然产物，在胃癌、肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中具有明显的抗癌作用[10-13]，但在胰腺癌中的研究鲜有报道。因此，本研究探讨FKB对人胰腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用，为今后开发新的抗胰腺癌药物提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞来源 人胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990购自武汉市同济医院肝胆胰外科实验室。

1.1.2主要试剂 FKB(美国Abcam公司)，培养基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美国Gibco公司)；6孔板、96孔板、Transwell小室(美国Corning公司)，细胞增殖毒性试剂盒(cell counting kit-8 ,CCK-8)试剂(日本Dojindo研究所)，Matrigel胶(美国BD公司)，波形蛋白(Vimentin)抗体、E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗体、Caspase-9抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(武汉Proteintech公司)，裂解缓冲液(radio immunoprecipitation ssay,RIPA)试剂、蛋白浓度测定试剂盒(bicinchoninic acid assay,BCA)及二甲基亚飒(dimethyl sulfoxide,DMSO；北京Solabio公司)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及分组 人胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、CO2含量为5%的恒温培养箱中孵育；当培养瓶中细胞生长至70%～80%后进行细胞传代用以后续实验；细胞分为对照组(0.1%DMSO)和5、10、20、40 μmol/L FKB组。

1.2.2CCK-8实验 将处于对数期生长的PANC-1和SW1990细胞消化并计数，分别以3×103个/孔将2株胰腺癌细胞种于多个96孔板上，设5组复孔。待细胞贴壁后，分别加入DMSO和不同浓度的FKB(分组同1.2.1项下分组方式)，24、48及72 h后吸弃废液，加PBS清洗，每孔加CCK-8试剂10 μL和无血清DMEM 100 μL，置于恒温培养箱孵育3 h，检测光密度(optical density，OD)值。

1.2.3平板克隆形成实验 将处于对数期生长的PANC-1和SW1990细胞消化并计数，分别以1×103个/孔将2株胰腺癌细胞种于6孔板上；待细胞贴壁后进行加药处理(分组同1.2.1项下分组方式)，添加DMEM培养液至5 mL；恒温培养箱中培养10～14 d后弃培养基，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加4%多聚甲醛1 mL固定30 min，吸弃后加1%结晶紫1 mL染色30 min，PBS清洗数遍，烘干，计数并拍照。

1.2.4Transwell实验 Matrigel与无血清的DMEM按1∶7的比例稀释，取50 μL加到Transwell上室待其凝固；将处于对数期生长的PANC-1和SW1990细胞消化进行饥饿处理24 h，分别取2×104个细胞种于小室内，加药处理(分组同1.2.1项下方式)；补无血清培养基至200 μL，下室加含20%胎牛血清的DMEM培养液700 μL；恒温培养箱孵育24 h，PBS清洗；加4%的多聚甲醛固定30 min，吸弃并加1%结晶紫染色30 min；PBS清洗，烘箱烘干，使用倒置光学显微镜拍照。

1.2.5Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9以及上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)蛋白Vimentin、E-cadherin及N-钙黏蛋白(N-cadherin) 将处于对数期生长的PANC-1和SW1990细胞消化后接种于6孔板中，进行药物处理(分组同1.2.1项下方式)；置于恒温培养箱培养24 h，吸弃废液，PBS清洗数遍，每孔加0.25%胰蛋白酶500 μL消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清；加RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白测定浓度试剂盒检测各分组的蛋白浓度；根据蛋白上清液按比例1∶5加5×loading buff，置于水中100 ℃煮沸5 min；每孔取蛋白上样品50 μg进行SDS-PAGE电泳，90 V电泳2 h，恒流300 mA转膜2 h；5%脱脂牛奶封闭30 min，把条带加入对应的Caspase-3、Caspase-9、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin一抗中置于4 ℃摇床上过夜；缓冲盐溶液(tris-HCl tween，TBST)清洗3次，10 min/次，将条带置于辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔IgG的二抗中孵育2 h，TBST清洗3次，10 min/次；使用增强型化学发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)进行显色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖

FKB的化学结构式见图1A。CCK8实验检测细胞的存活率结果显示(图1B和1C)，与DMSO组对比，FKB能抑制胰腺癌细胞的增殖，并且以浓度和时间依赖的方式对PANC-1和SW1990的抑制能力逐渐加强(P<0.05)；平板克隆实验检测结果显示(图1D～1F)，随着FKB的浓度增加，对PANC-1和SW1990的抑制效果越发明显(P<0.05)。上述结果表明，FKB能够抑制胰腺癌细胞PANC-1和SW1990增殖能力。

注：A为FKB化学结构式，B、C为CCK-8实验结果，D～F分别为细胞平板克隆实验结果及定量结果；(1)与同时点DMSO组比较，P<0.05；(2)与同细胞DMSO组比较，P<0.05。

2.2 细胞侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示，随着FKB的浓度逐渐增加，穿过小室的胰腺癌细胞数减少，表明随着FKB的浓度增加，PANC-1和SW1990的侵袭能力逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：A～C分别为Transwell实验胰腺癌细胞侵袭能力的形态学和定量结果；(1)与同细胞DMSO组比较，P<0.05。

2.3 Vimentin、N-Cadherin及E-Cadherin蛋白的表达

蛋白质印迹实验表明，与DMSO组对比，当FKB的浓度逐渐上升后，Vimentin蛋白和N-Cadherin蛋白的表达逐渐下降，而E-Cadherin蛋白的表达水平呈上升趋势(P<0.05)，表明FKB以浓度依赖方式抑制胰腺癌细胞的EMT蛋白表达(图3)。

注：A为Western blot实验结果，B、C为PANC-1和SW1190的EMT蛋白定量结果；(1)与同蛋白DMSO组比较，P<0.05。

2.4 Caspase-3和Caspase-9的表达

蛋白质印迹实验提示，与DMSO组对比，随着FKB的浓度逐渐上升后，Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05)，表明FKB以浓度依赖方式促进胰腺癌细胞的凋亡蛋白表达(图4)。

注：A为Western blot实验结果，B、C为凋亡蛋白定量结果；(1)与同蛋白DMSO组比较，P<0.05。

3 讨论

胰腺癌由于发病早期无明显症状，转移性强且进展迅速，通常患者被诊断时已为晚期，失去手术机会[14]。目前临床上常用的抗肿瘤药物为吉西他滨，但因副作用大导致治疗效果不理想[15]。所以迫切需要研究新的抗肿瘤药物。最近有研究表明，天然产物在预防和治疗癌症方面有一定的应用价值[16]。FKB是一种天然产物，源自于南太平洋岛屿学名为卡瓦的灌木[17]。有流行病学研究表明，在瓦努阿图、斐济及西萨摩亚等饮用卡瓦酒的国家中，居民的肿瘤发病率只占非卡瓦饮酒国家的1/3[18]。Li等[19]研究发现FKB通过靶向髓样分化因子2减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。Celentano 等[20]研究表明FKB能够在体外对口腔鳞状细胞癌细胞发挥选择性的抗癌作用。因此将FKB作为本研究对象探寻其是否在体外能对胰腺癌细胞发挥抗肿瘤活性作用。

本研究CCK-8实验和平板克隆结果显示，与DMSO组相比，FKB以浓度-时间依赖的方式抑制胰腺癌细胞的增殖能力；Transwell侵袭实验显示，加药组胰腺癌细胞中侵袭细胞数低于DMSO组，表明FKB能有效地减弱胰腺癌细胞的侵袭能力。细胞凋亡即程序性细胞死亡，其过程包括凋亡信号传导阶段、凋亡调控分子间的相互作用、蛋白水解酶的活化及进入连续反应过程[21]。大量研究表明，Caspase家族在凋亡过程中起着关键性作用[22-23]。当细胞接收凋亡诱导信号后会传递给启动性型Caspase，使其转化为二聚体并活化，开启细胞内的凋亡程序[24]。本研究Western blot实验结果显示，加药组胰腺癌细胞能够促进凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表达增加，表明FKB能促进胰腺癌细胞的凋亡。

EMT是指上皮细胞通过特定的程序转化为成具有高度迁移能力的间质细胞过程，在癌症的侵袭和转移过程中扮演着重要的角色[25]。在发生EMT的上皮细胞中，上皮标记物 E-cadherin的表达降低与间充质标志物N-cadherin、Vimentin表达升高是EMT的重要特征[26-27]。本研究结果表明，加药组胰腺癌细胞中E-cadherin表达增加，N-cadherin和Vimentin的表达呈下降趋势并呈浓度依赖性，表明FKB能够抑制胰腺癌细胞的EMT进程，干预肿瘤细胞的EMT状态。

综上所述，FKB能够促进胰腺癌细胞E-cadherin的表达，并抑制N-cadherin、Vimentin、Caspase-3和Caspase-9表达，从而促进凋亡并抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移。本研究证实了FKB在体外能够抑制胰腺癌细胞，具有治疗胰腺癌的新药物的潜力，但若要进一步用于临床还需要进行体内外研究和临床研究。