柴芩四君子汤对胆囊切除术后患者粪胆汁酸代谢的影响

赵元辰，崔乃强，关 鑫，李棣华，张昀昊，张淑坤

胆囊切除术后患者常出现胆汁酸代谢异常及胃肠道功能障碍等。有研究发现，胆囊切除术后2月以上的患者粪总胆汁酸（TBA）和脱氧胆酸（DCA）浓度均显著高于胆囊切除前，而肠道DCA浓度增高是诱发大肠癌的主要原因[1-2]。中医药以脏腑生理功能为中心，对术后患者胃肠道功能调节具有独特的治疗优势，如四君子汤等。现代中医药研究发现，柴胡类方剂对胆汁酸代谢有一定的调节作用。本研究选取胆囊结石患者43例，分为胆囊切除术后对照组、柴芩四君子汤组。采用液相色谱质谱法（LC-MS）检测胆囊切除术前1 d、术后7 d和14 d粪胆汁酸成分和浓度，研究柴芩四君子汤对胆囊切除术后患者近期粪胆汁酸代谢的影响，以期揭示中药对胆囊切除后粪胆汁酸代谢调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂 电子分析天平BT-124S（北京赛多利斯仪器系统有限公司），Milli-Q Gradient A10超纯水器（美国Millipore Inc），5种胆汁酸标准品：胆酸（cholic acid, CA）、鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid, CDCA）、DCA、石胆酸（lithocholic acid, LCA）和熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA），纯度≥95%，甲醇（美国Sigma公司），甲酸（Fisher公司），KQ-250B 型超声波清洗器（上海医科大学仪器厂 ），Inert Sustain C18柱（150 mm×2.1 mm内径，3 μm粒径，日本东京G和L科学公司），MicroOTOF(Q)型液相色谱/质谱联用仪（美国Bruker Daltonics Inc）。

1.2 粪便获取 本试验遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究的法律法规，经天津市南开医院伦理委员会批准，每位受试者均签署知情同意书。选取2017年10月至2019年9月在天津市南开医院诊断为胆囊结石并行胆囊切除术的患者43例，年龄（50.19±13.28）岁，其中男性16例，女性27例。所有患者在收集粪便期间未服用任何药物，饮食习惯如常。分别于术前1 d、术后7 d和14 d用洁净的一次性便盆收集患者24 h粪便，机械性混匀后精密称取5 g，密封并标记，于-80 ℃冰箱贮存。

1.3 粪胆汁酸检测

1.3.1 粪便标本预处理 粪便标本于66 ℃烘干，充分研碎，精确称取10 mg，加入4 mL甲醇，超声萃取5 min，4 000 r/min离心5 min，取上清，经0.22 μm微孔过滤器过滤后4 ℃备用。

1.3.2 确定色谱和质谱条件 色谱条件：在40 ℃下，Inert Sustain C18柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）流动相为CH3CN(A)和H20(含0.1%甲酸)(B)，采用梯度洗脱法，0～10 min，B为40%；10～15 min，B由40%变化至55%；15～25 min，B为55%；25～26 min，B由55%变化至90%；26～32 min，B 为 90%；32～33 min，B 由 90%变化至40%；33～35 min，B为 40%。流速0.2 mL/min，进样量10 μL；总运行时间是35 min。

质谱条件：采用ESI负离子模式选择性离子检测法，干燥气体（N2）流速4 L/min，辅助气（N2）压设定为0.3 bar，干燥气体温度180 ℃，毛细管电压4 000 V。碰撞气体（氩）压力和碰撞能量分别保持在0.4 psi和15 eV。定量分析离子分别为m/z 407.5 CA，m/z 391.5 CDCA、DCA、UDCA，m/z 375.5 LCA。

在LC-MS设定条件下，CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA峰形良好，各峰均获得完全分离，保留时间(tR)分别为8.8、11.5、19.7、20.5、30.4 min。用上述样品处理方法及检测条件分析粪便样品，所得色谱-质谱图（图1～7）。

图1 标准品的胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图2 对照组术前1 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图3 柴芩四君子汤组术前1 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图4 对照组术后7 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图5 柴芩四君子汤组术后7 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图6 对照组术后14 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

图7 柴芩四君子汤组术后14 d粪胆汁酸色谱-质谱图（1：CA；2：UDCA；3：CDCA；4：DCA；5：LCA）

1.4 制备标准曲线 将CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA标准品用95%乙醇溶液，配制成浓度为100 μg/mL的标准品混合液；精密量取混合液，用甲醇水（1:1）分别稀释成终浓度为1500、500、150、50、15、5 ng/mL的标准液。随后按浓度从低到高各取10 μL标准液依次进样检测，得出CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA的线性范围为 5～1500 ng/mL(r＞0.999，n=6)，回归方程见表 1。

表1 线性回归方程

1.5 样本检测和计算 取预处理的粪便上清自然解冻，涡旋混匀后取10 μL进样，测定并计算样本中CA、CDCA、DCA、LCA和UDCA含量。初级胆汁酸（PBA）= CA+CDCA，次级胆汁酸（SBA）= DCA+LCA+UDCA，TBA= PBA+ SBA。

1.6 实验药材 柴芩四君子汤组方：柴胡10 g，党参10 g，黄芩10 g，白术10 g，茯苓10 g，甘草6 g。由天津市南开医院颗粒剂药房提供，由红日药业生产。服用方法：患者于术后第1天开始服药，每天1剂，早晚分服，连服14 d。

1.7 统计学方法 数据采用SPSS 24.0统计学软件进行分析，计量资料以±s表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粪胆汁酸成分和含量 两组术前1 d粪CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA、TBA、PBA和SBA含量差异均无统计学意义。与对照组比较，柴芩四君子汤组术后7 d粪LCA含量降低（P=0.020），术后14 d粪CA、PBA含量均升高（均P＜0.05），粪DCA、LCA、SBA含量均降低（均P＜0.05），余胆汁酸含量差异无显著性。见表2～4。

表2 胆囊切除术前1 d两组粪胆汁酸成分和含量

表3 中药对胆囊切除术后7 d粪胆汁酸成分和含量的影响

表4 中药对胆囊切除术后14 d粪胆汁酸成分和含量的影响

2.2 中药对各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响 柴芩四君子汤组与对照组比较，术后7 d粪 CA/TBA 升 高（P=0.014），LCA/TBA降低（P=0.012）；术后14 d粪CA/TBA、CDCA/TBA、UDCA/TBA均升高（均P＜0.05），DCA/TBA、LCA/TBA均降低（均P＜0.05）。见表5～7。

表5 胆囊切除术前1 d两组各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比

表6 中药对胆囊切除术后7 d各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

表7 中药对胆囊切除术后14 d各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

2.3 中药对初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响 柴芩四君子汤组与对照组比较，术前1 d，术后7 d粪PBA/TBA、SBA/TBA差异无统计学意义；术后14 d，粪PBA/TBA升高，SBA/ TBA降低，差异均有统计学意义（P=0.001）。见表8～10。

表8 胆囊切除术前1 d两组初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比

表9 中药对胆囊切除术后7 d初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

表10 中药对胆囊切除术后14 d初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

3 讨论

胆囊切除后，储存和浓缩胆汁的功能丧失，胆汁酸分泌、排泄和重吸收均受到影响。此时，胆汁的排出不再受进食调节，肝细胞分泌的胆汁酸直接进入肠道，刺激肠壁，可引起肠蠕动增强。还有研究表明，肠壁长时间接触胆汁酸，尤其是次级胆汁酸，可增加慢性腹泻和结直肠癌的发生风险[3]。

本研究对胆囊切除后对照组、柴芩四君子汤组患者粪胆汁酸成分含量和占比进行对比分析。与对照组比较，柴芩四君子汤组术后14 d初级胆汁酸含量及占比均升高，次级胆汁酸含量及占比均降低。进一步研究发现柴芩四君子汤组术后14 d CA含量及占比升高，UDCA占比升高，DCA、LCA含量及占比均降低。这些结果说明柴芩四君子汤可以调节CA、DCA及LCA含量及各胆汁酸占比。粪初级胆汁酸绝对和相对含量增加是由于CA含量和CA、CDCA相对含量增加导致。次级胆汁酸绝对和相对含量降低与DCA、LCA绝对和相对含量降低有关。

中草药是中华民族的瑰宝，已有几千年历史。中药的成分众多，药理作用广泛。以其天然性、整体调节、扶正祛邪、双向调节作用在疾病的预防、治疗中起着重要的作用[4-6]。研究发现柴胡类方剂在胆汁酸代谢中具有良好的调节作用[7-8]。

柴胡中的主要成分柴胡皂苷具有解热、镇痛、抗炎，促进肝细胞分泌胆汁和收缩胆囊、胆管平滑肌的作用。柴胡皂苷可激活肝X受体α（liver X receptor α, LXRα），通过胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1）基因上游的LXRα反应元件来增加CYP7A1基因表达，从而促进胆汁酸合成。柴胡皂苷能够升高肝纤维化动物血清中的NO水平，介导胆汁形成。卓玉珍等[9]釆用多种方法研究柴胡对大鼠的利胆作用，发现柴胡可增加正常大鼠的胆汁流量。周崇坦等[10]研究发现黄芩含有的总黄酮能够抑制胆盐吸收，促进胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸。体外研究发现黄芩苷能够促进胆汁酸生成[11]。现代药理研究发现甘草中的甘草次酸能抑小分子异源二聚体伴侣（smallheterodimer partner, SHP）、法尼醇受体（farnesoid X receptor, FXR）靶基因的表达，可激活LXRa，进而促进胆汁酸生成。

补益中药多含有蛋白质、多糖、微量元素、维生素等多种营养成分，具有多种药理作用，可以直接或间接为机体提供能量。故本研究应用四君子汤增强益气健脾之功，为机体供能，调节机体的功能代谢。胆汁酸的代谢是一个耗能过程，如游离胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的C-24缀合需要ATP参与[12]。毛细胆管胆汁酸盐输出泵是主要的胆汁酸外排泵，分泌结合胆汁酸需要能量。肝细胞基底侧膜钠-牛磺酸共转运体（Na+/taurocholate cotransporting polypeptid, NTCP）从血液中重吸收胆汁酸进入肝细胞需要能量。能量是恢复胆汁酸正常代谢，促进机体功能恢复的重要因素。

本研究并没有检测到柴芩四君子汤组术后粪CDCA含量显著升高，这可能与不同个体之间粪胆汁酸成分含量变异较大、检测例数不够多有关。

综上，本研究发现柴芩四君子汤可以调节粪PBA、SBA含量，而CA、DCA、LCA含量改变可能是引起这一变化的主要原因。肠道胆汁酸代谢与肠道菌群密切相关，已有研究证实7α-脱羟基酶是CA、CDCA转化为DCA、LCA的主要酶[13-14]，厚壁菌门是产生7α-脱羟基酶的主要细菌[15-16]。柴芩四君子汤可能通过调节肠道菌群，降低肠道中7α-脱羟基酶，进一步改善肠道胆汁酸结构，但仍需进一步研究。深入研究胆汁酸代谢与肠道微生态之间的关系，有助于揭示中药对胆囊切除后胆汁酸代谢的调节机制。