柴芩四君子汤对胆囊切除术后患者粪胆汁酸代谢的影响

2022-08-16 07:10赵元辰崔乃强李棣华张昀昊张淑坤
中国中西医结合外科杂志 2022年4期
关键词:四君子汤胆汁酸质谱

赵元辰,崔乃强,关 鑫,李棣华,张昀昊,张淑坤

胆囊切除术后患者常出现胆汁酸代谢异常及胃肠道功能障碍等。有研究发现,胆囊切除术后2月以上的患者粪总胆汁酸(TBA)和脱氧胆酸(DCA)浓度均显著高于胆囊切除前,而肠道DCA浓度增高是诱发大肠癌的主要原因[1-2]。中医药以脏腑生理功能为中心,对术后患者胃肠道功能调节具有独特的治疗优势,如四君子汤等。现代中医药研究发现,柴胡类方剂对胆汁酸代谢有一定的调节作用。本研究选取胆囊结石患者43例,分为胆囊切除术后对照组、柴芩四君子汤组。采用液相色谱质谱法(LC-MS)检测胆囊切除术前1 d、术后7 d和14 d粪胆汁酸成分和浓度,研究柴芩四君子汤对胆囊切除术后患者近期粪胆汁酸代谢的影响,以期揭示中药对胆囊切除后粪胆汁酸代谢调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂 电子分析天平BT-124S(北京赛多利斯仪器系统有限公司),Milli-Q Gradient A10超纯水器(美国Millipore Inc),5种胆汁酸标准品:胆酸(cholic acid, CA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid, CDCA)、DCA、石胆酸(lithocholic acid, LCA)和熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA),纯度≥95%,甲醇(美国Sigma公司),甲酸(Fisher公司),KQ-250B 型超声波清洗器(上海医科大学仪器厂 ),Inert Sustain C18柱(150 mm×2.1 mm内径,3 μm粒径,日本东京G和L科学公司),MicroOTOF(Q)型液相色谱/质谱联用仪(美国Bruker Daltonics Inc)。

1.2 粪便获取 本试验遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究的法律法规,经天津市南开医院伦理委员会批准,每位受试者均签署知情同意书。选取2017年10月至2019年9月在天津市南开医院诊断为胆囊结石并行胆囊切除术的患者43例,年龄(50.19±13.28)岁,其中男性16例,女性27例。所有患者在收集粪便期间未服用任何药物,饮食习惯如常。分别于术前1 d、术后7 d和14 d用洁净的一次性便盆收集患者24 h粪便,机械性混匀后精密称取5 g,密封并标记,于-80 ℃冰箱贮存。

1.3 粪胆汁酸检测

1.3.1 粪便标本预处理 粪便标本于66 ℃烘干,充分研碎,精确称取10 mg,加入4 mL甲醇,超声萃取5 min,4 000 r/min离心5 min,取上清,经0.22 μm微孔过滤器过滤后4 ℃备用。

1.3.2 确定色谱和质谱条件 色谱条件:在40 ℃下,Inert Sustain C18柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)流动相为CH3CN(A)和H20(含0.1%甲酸)(B),采用梯度洗脱法,0~10 min,B为40%;10~15 min,B由40%变化至55%;15~25 min,B为55%;25~26 min,B由55%变化至90%;26~32 min,B 为 90%;32~33 min,B 由 90%变化至40%;33~35 min,B为 40%。流速0.2 mL/min,进样量10 μL;总运行时间是35 min。

质谱条件:采用ESI负离子模式选择性离子检测法,干燥气体(N2)流速4 L/min,辅助气(N2)压设定为0.3 bar,干燥气体温度180 ℃,毛细管电压4 000 V。碰撞气体(氩)压力和碰撞能量分别保持在0.4 psi和15 eV。定量分析离子分别为m/z 407.5 CA,m/z 391.5 CDCA、DCA、UDCA,m/z 375.5 LCA。

在LC-MS设定条件下,CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA峰形良好,各峰均获得完全分离,保留时间(tR)分别为8.8、11.5、19.7、20.5、30.4 min。用上述样品处理方法及检测条件分析粪便样品,所得色谱-质谱图(图1~7)。

图1 标准品的胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图2 对照组术前1 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图3 柴芩四君子汤组术前1 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图4 对照组术后7 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图5 柴芩四君子汤组术后7 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图6 对照组术后14 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

图7 柴芩四君子汤组术后14 d粪胆汁酸色谱-质谱图(1:CA;2:UDCA;3:CDCA;4:DCA;5:LCA)

1.4 制备标准曲线 将CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA标准品用95%乙醇溶液,配制成浓度为100 μg/mL的标准品混合液;精密量取混合液,用甲醇水(1:1)分别稀释成终浓度为1500、500、150、50、15、5 ng/mL的标准液。随后按浓度从低到高各取10 μL标准液依次进样检测,得出CA、UDCA、CDCA、DCA、LCA的线性范围为 5~1500 ng/mL(r>0.999,n=6),回归方程见表 1。

表1 线性回归方程

1.5 样本检测和计算 取预处理的粪便上清自然解冻,涡旋混匀后取10 μL进样,测定并计算样本中CA、CDCA、DCA、LCA和UDCA含量。初级胆汁酸(PBA)= CA+CDCA,次级胆汁酸(SBA)= DCA+LCA+UDCA,TBA= PBA+ SBA。

1.6 实验药材 柴芩四君子汤组方:柴胡10 g,党参10 g,黄芩10 g,白术10 g,茯苓10 g,甘草6 g。由天津市南开医院颗粒剂药房提供,由红日药业生产。服用方法:患者于术后第1天开始服药,每天1剂,早晚分服,连服14 d。

1.7 统计学方法 数据采用SPSS 24.0统计学软件进行分析,计量资料以±s表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粪胆汁酸成分和含量 两组术前1 d粪CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA、TBA、PBA和SBA含量差异均无统计学意义。与对照组比较,柴芩四君子汤组术后7 d粪LCA含量降低(P=0.020),术后14 d粪CA、PBA含量均升高(均P<0.05),粪DCA、LCA、SBA含量均降低(均P<0.05),余胆汁酸含量差异无显著性。见表2~4。

表2 胆囊切除术前1 d两组粪胆汁酸成分和含量

表3 中药对胆囊切除术后7 d粪胆汁酸成分和含量的影响

表4 中药对胆囊切除术后14 d粪胆汁酸成分和含量的影响

2.2 中药对各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响 柴芩四君子汤组与对照组比较,术后7 d粪 CA/TBA 升 高(P=0.014),LCA/TBA降低(P=0.012);术后14 d粪CA/TBA、CDCA/TBA、UDCA/TBA均升高(均P<0.05),DCA/TBA、LCA/TBA均降低(均P<0.05)。见表5~7。

表5 胆囊切除术前1 d两组各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比

表6 中药对胆囊切除术后7 d各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

表7 中药对胆囊切除术后14 d各成分胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

2.3 中药对初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响 柴芩四君子汤组与对照组比较,术前1 d,术后7 d粪PBA/TBA、SBA/TBA差异无统计学意义;术后14 d,粪PBA/TBA升高,SBA/ TBA降低,差异均有统计学意义(P=0.001)。见表8~10。

表8 胆囊切除术前1 d两组初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比

表9 中药对胆囊切除术后7 d初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

表10 中药对胆囊切除术后14 d初、次级胆汁酸在粪总胆汁酸中占比的影响

3 讨论

胆囊切除后,储存和浓缩胆汁的功能丧失,胆汁酸分泌、排泄和重吸收均受到影响。此时,胆汁的排出不再受进食调节,肝细胞分泌的胆汁酸直接进入肠道,刺激肠壁,可引起肠蠕动增强。还有研究表明,肠壁长时间接触胆汁酸,尤其是次级胆汁酸,可增加慢性腹泻和结直肠癌的发生风险[3]。

本研究对胆囊切除后对照组、柴芩四君子汤组患者粪胆汁酸成分含量和占比进行对比分析。与对照组比较,柴芩四君子汤组术后14 d初级胆汁酸含量及占比均升高,次级胆汁酸含量及占比均降低。进一步研究发现柴芩四君子汤组术后14 d CA含量及占比升高,UDCA占比升高,DCA、LCA含量及占比均降低。这些结果说明柴芩四君子汤可以调节CA、DCA及LCA含量及各胆汁酸占比。粪初级胆汁酸绝对和相对含量增加是由于CA含量和CA、CDCA相对含量增加导致。次级胆汁酸绝对和相对含量降低与DCA、LCA绝对和相对含量降低有关。

中草药是中华民族的瑰宝,已有几千年历史。中药的成分众多,药理作用广泛。以其天然性、整体调节、扶正祛邪、双向调节作用在疾病的预防、治疗中起着重要的作用[4-6]。研究发现柴胡类方剂在胆汁酸代谢中具有良好的调节作用[7-8]。

柴胡中的主要成分柴胡皂苷具有解热、镇痛、抗炎,促进肝细胞分泌胆汁和收缩胆囊、胆管平滑肌的作用。柴胡皂苷可激活肝X受体α(liver X receptor α, LXRα),通过胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)基因上游的LXRα反应元件来增加CYP7A1基因表达,从而促进胆汁酸合成。柴胡皂苷能够升高肝纤维化动物血清中的NO水平,介导胆汁形成。卓玉珍等[9]釆用多种方法研究柴胡对大鼠的利胆作用,发现柴胡可增加正常大鼠的胆汁流量。周崇坦等[10]研究发现黄芩含有的总黄酮能够抑制胆盐吸收,促进胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸。体外研究发现黄芩苷能够促进胆汁酸生成[11]。现代药理研究发现甘草中的甘草次酸能抑小分子异源二聚体伴侣(smallheterodimer partner, SHP)、法尼醇受体(farnesoid X receptor, FXR)靶基因的表达,可激活LXRa,进而促进胆汁酸生成。

补益中药多含有蛋白质、多糖、微量元素、维生素等多种营养成分,具有多种药理作用,可以直接或间接为机体提供能量。故本研究应用四君子汤增强益气健脾之功,为机体供能,调节机体的功能代谢。胆汁酸的代谢是一个耗能过程,如游离胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的C-24缀合需要ATP参与[12]。毛细胆管胆汁酸盐输出泵是主要的胆汁酸外排泵,分泌结合胆汁酸需要能量。肝细胞基底侧膜钠-牛磺酸共转运体(Na+/taurocholate cotransporting polypeptid, NTCP)从血液中重吸收胆汁酸进入肝细胞需要能量。能量是恢复胆汁酸正常代谢,促进机体功能恢复的重要因素。

本研究并没有检测到柴芩四君子汤组术后粪CDCA含量显著升高,这可能与不同个体之间粪胆汁酸成分含量变异较大、检测例数不够多有关。

综上,本研究发现柴芩四君子汤可以调节粪PBA、SBA含量,而CA、DCA、LCA含量改变可能是引起这一变化的主要原因。肠道胆汁酸代谢与肠道菌群密切相关,已有研究证实7α-脱羟基酶是CA、CDCA转化为DCA、LCA的主要酶[13-14],厚壁菌门是产生7α-脱羟基酶的主要细菌[15-16]。柴芩四君子汤可能通过调节肠道菌群,降低肠道中7α-脱羟基酶,进一步改善肠道胆汁酸结构,但仍需进一步研究。深入研究胆汁酸代谢与肠道微生态之间的关系,有助于揭示中药对胆囊切除后胆汁酸代谢的调节机制。

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