基质金属蛋白酶-13介导OPG/RANKL/RANK通路调控骨癌痛*

于明良，李 鹏，余 丹，尹平平，彭晓红

武汉市第四医院麻醉科,武汉 430022

骨癌痛是由原发性肿瘤或者其他部位肿瘤骨转移所引起的一种顽固而难治的慢性疼痛综合征，其兼具炎性痛和神经病理性疼痛的部分特质，又不同于这两种疼痛。因其独特而复杂的病理发展过程，目前人们对其生物学机制尚不完全清楚，癌痛三阶梯靶控治疗效果不甚理想，超过90%的进展期及终末期癌症患者几乎难以控制癌痛[1]。因此，研究骨癌痛的发生发展机制，寻找和开发新的疼痛阻断途径具有重要意义。基质金属蛋白酶-13(MMP-13)作为内源性酶超家族中唯一能够裂解胶原分子三维螺旋结构的酶类，其结构高度保守。生理条件下，MMP-13能够通过降解细胞外基质影响细胞分化、迁移、血管形成、存活和凋亡[2-3]。病理条件下，其参与关节炎、动脉粥样硬化、血管炎症反应及恶性肿瘤的生长、侵袭、转移等病理过程[4-5]。目前的研究表明，MMP-13参与了软骨重塑和骨替代过程中对软骨细胞外胶原基质(ECM)的降解过程，其可通过降解和破坏Ⅱ型胶原及聚蛋白多糖而引发软骨细胞的变形坏死，因而与影响骨骼重塑和炎症的发生发展密切相关[6]。目前骨癌痛的调控机制尚不完全清楚，MMP-13在其发生发展过程中作用的研究鲜见报道。本研究拟探讨MMP-13在骨癌痛产生和维持中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及主要仪器

Walker 256乳腺癌细胞(上海雅吉生物，货号YS1363C)，MMP-13特异性抑制剂CL-82198(北京百奥莱博科技有限公司，货号M01395)，兔抗鼠MMP-13多克隆抗体(三鹰生物，货号18165-1-AP)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，货号80096618)，苏木精(美国Sigma公司，货号H9627-25G)，倒置白光/荧光拍照显微镜(日本OLYMPUS)，Von Frey纤维丝(美国North Coast Medical公司)，7370型热痛仪(意大利UGO公司)，病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)。

1.2 动物模型制备及用药

选择雌性SD大鼠，SPF级，体质量(170±20)g，幼鼠体质量(60±10)g，由湖北省实验动物研究中心提供。动物自由饮水进食，12 h昼夜循环，实验方案经武汉市第四医院实验动物伦理委员会审议并批准。雌性幼鼠腹腔注射Walker 256乳腺癌细胞0.5 mL，7 d后取腹水，调整细胞密度为1×104个/mL。40只雌性SD大鼠，每组10只，随机分为假手术组(S组)、骨癌痛组(BCP组)、骨癌痛+生理盐水组(NS组)、骨癌痛+CL-82198组(CL组)。参考Shenoy等[7]的方法构建乳腺癌骨转移模型，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉后左后肢备皮，消毒，胫骨上段行约1 cm切口，钝性分离软组织，于胫骨平台下约0.5 cm处用1 mL注射器针头钻至骨髓腔，微量注射器缓慢注射0.01 mL Walker 256肿瘤细胞悬液。骨蜡封孔，消毒伤口，创面给予青霉素，缝合。S组骨髓腔注射0.01 mL 0.9 %氯化钠注射液。NS组和CL组术后第7天起分别腹腔注射给药干预，NS组腹腔注射生理盐水1 mL、CL组腹腔注射CL-82198 5 mg/kg，每48 h给药1次，连续2周。

1.3 X线检测大鼠胫骨破坏情况

术后21 d，为了确定造模成功及观察肿瘤对骨质的破坏情况，将S组和BCP组大鼠给予10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定，行胫骨X线检查，观察骨质破坏情况。

1.4 苏木精-伊红染色(HE)检测

取S组和BCP组大鼠患侧胫骨，4%多聚甲醛固定，脱钙3周。常规脱水、石蜡包埋切片、染色、胶封固定，显微镜下观察胫骨组织形态，拍照。

1.5 疼痛评估

通过Von Frey丝和热辐射仪测量大鼠模型的机械缩足阈值(paw withdrawl threshold，PWT)和热缩足潜伏期(paw withdrawl latency，PWL)，以评估机械痛阈和热痛阈[8]。对于PWT测量，将大鼠放于金属透明网格笼里，先适应30 min，Von Frey纤维丝自下而上刺激大鼠后足足趾底部中心，大鼠迅速退缩或舔爪子则记为阳性，否则为阴性。用up-and-down法计算100%机械缩足阈值即为机械痛阈值。对于PWL测量，将大鼠置于透明玻璃上，强热光照射大鼠左后足脚掌中心皮肤，记录大鼠缩爪反应时间，代表热痛阈值(为防止烫伤大鼠，热痛刺激仪切断时间为20 s，间隔5 min)。

1.6 Western blot检测MMP-13蛋白表达

取部分瘤组织加入裂解液，裂解匀浆后提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法行蛋白浓度定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜8次，每次5 min，加入ECL显像曝光。Image J软件对条带灰度值进行定量分析，以目标蛋白与内参GAPDH的比值作为其相对含量。

1.7 qRT-PCR法测定MMP-13、RANK、RANKL和OPG mRNA表达

取部分瘤组织，液氮研磨，采用Trizol试剂法从组织细胞中提取总RNA，逆转录合成互补链cDNA。随后，使用SYBR GREEN PCR试剂盒(Applied Biosystems，中国上海)行RT-PCR检测，参照试剂盒说明书设定反应体系。以GAPDH基因作为内参，对样品校正后采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子(RANK)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及MMP-13的引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 骨癌痛模型建立

与S组相比，BCP组大鼠术后7 d接种肿瘤的左后肢开始出现骨质膨胀、肢体肿胀。术后21 d胫骨X线检测，与S组相比，BCP组大鼠胫骨有明显的骨质破坏，骨皮质不连续，明显缺损，髓质骨损失，有肿瘤生长(图1)。HE染色显示，与S组相比，BCP组大鼠胫骨骨小梁及骨髓腔内充满肿瘤细胞，生长活跃，穿破骨皮质，出现骨质破坏。肿瘤细胞呈现异形核、多核、分叶核等(图2)，提示骨癌痛模型建立成功。

A：S组；B：BCP组图1 大鼠胫骨X线检查结果Fig.1 X-ray results of rat tibia

A：S组；B：BCP组图2 大鼠胫骨苏木精-伊红染色结果(×200)Fig.2 HE staining results of rat tibia(×200)

2.2 大鼠机械痛阈与热痛阈改变情况

各组大鼠在术前1 d的机械痛阈和热痛阈比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。较术前1 d及S组，BCP组大鼠术后7 d出现了机械痛阈和热痛阈的明显降低，并持续至实验结束(均P<0.05)，说明骨癌痛大鼠出现了机械痛和热痛敏；较BCP组和NS组，CL组大鼠在术后的11、14及21 d都出现了机械痛阈值和热痛阈值的明显升高(均P<0.05)，提示MMP-13特异性抑制剂CL-82198可缓解骨癌痛大鼠的机械痛和热痛敏(均P<0.05)。见表2、表3。

表2 各组大鼠不同时点机械缩足阈值的变化Table 2 Changes of paw withdrawl threshold in rats among differert groups at different time

表3 各组大鼠不同时点热缩足潜伏期的变化Table 3 Changes of paw withdrawl latency in rats among different groups at different time

2.3 大鼠肿瘤组织中OPG、RANK及RANKL的mRNA表达

与S组比较，BCP组及NS组RANK mRNA、RANKL mRNA的表达量均明显升高，OPG mRNA表达量及OPG/RANKL比值均明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)；与BCP组比较，NS组RANK mRNA、RANKL mRNA、OPG mRNA及OPG/RANKL比值差异均无统计学意义(均P>0.05)；较BCP组和NS组，CL组RANK mRNA、RANKL mRNA的表达量均明显降低，OPG mRNA表达量及OPG/RANKL比值均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠OPG、RANK、RANKL的mRNA表达Table 4 The expression levels of OPG mRNA，RANK mRNA and RANKL mRNA in each

2.4 大鼠肿瘤组织中MMP-13的表达

与S组比较，BCP组MMP-13 mRNA和蛋白的表达量均明显增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与BCP组比较，NS组MMP-13 mRNA和蛋白的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)；较BCP组和NS组，CL组MMP-13 mRNA和蛋白的表达量均明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图3。

*P<0.05；**P<0.01图3 各组大鼠肿瘤组织中MMP-13 mRNA及蛋白表达Fig.3 Expression levels of MMP-13 mRNA and protein in tumor tissues of rats in each group

3 讨论

晚期癌症患者经常在骨转移后出现癌痛，并伴有溶骨性病变和剧烈疼痛[9]。研究表明，约75%的晚期癌症患者会经历中度或重度疼痛[10]，并且超过50%的转移性癌痛患者，目前可用的药物疗法无法充分缓解疼痛[11]。转移性癌症患者的疼痛控制不充分通常伴随着抑郁、焦虑、功能受损和生活质量的显著降低，导致发病率和死亡率增加[12]。骨骼需要不断更新，骨重塑由成骨细胞进行的骨沉积和破骨细胞负责的骨吸收之间的平衡精细调节[13]。而维持内部环境中的矿物质稳态，主要由基质金属蛋白酶(MMP)介导。MMP-13是MMP中的一种，参与正常生理过程(如胚胎发育、繁殖和组织重塑)以及疾病过程(如关节炎和椎间盘退变)中细胞外基质的分解。MMP-13的突变与包括癌症和关节炎在内的各种病理改变有关[14]。

RANKL及其受体RANK和OPG是肿瘤坏死因子(TNF)和TNF受体家族的一部分。它们都是骨代谢的关键调节剂[15-16]。RANKL主要由成骨细胞分泌，通过与未成熟破骨细胞上的RANK结合，诱导破骨细胞分化为成熟破骨细胞，从而调节骨吸收。动物实验表明RANKL基因敲除的小鼠会出现明显的破骨细胞分化障碍，表现为出牙困难和骨硬化病[17]。而RANK基因敲除的小鼠会出现成熟破骨细胞减少，B细胞、T细胞分化障碍，亦表现为严重的骨硬化病[18]。研究发现RANK需要通过接头蛋白如TRAF(TNF-receptor associated factor)来传递细胞信号，与RANKL结合后，通过活化磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、转录因子核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)等信号通路来激活T细胞的胞质核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)。RANKL还能触发c-Fos的表达，c-Fos是激活蛋白-1转录因子复合物的主要成分，可诱导NFATc1的表达[19]。激活的NFATc1可以诱导破骨前体细胞增殖，促进骨重吸收，并形成酸性环境，使酸敏感离子通道3(ASIC-3)和辣椒素受体1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)激活，导致痛觉过敏，促进骨癌痛的发展。

OPG是肿瘤坏死因子受体家族的一员，具有抑制破骨细胞分化和增加骨密度的作用[20]。OPG通过阻断RANKL与RANK的结合来抑制破骨细胞分化和活性，从而抑制骨吸收[21-22]。因此，OPG表达与RANKL和RANK表达呈负相关。OPG可以有效阻止RANKL和RANK相互作用从而抑制破骨细胞分化并促进其凋亡。研究表明敲除OPG基因的小鼠会出现骨质减少和骨质疏松症。血液中的RANKL/OPG比值增加，是导致病理性骨重塑和骨肉瘤生长之间建立恶性循环的关键[23]。相关研究发现RANKL/OPG的比值是骨吸收增加的早期预测指标，如果比值增高，则破骨细胞形成活跃，反之，则破骨细胞形成受到抑制，因此它可能是骨损伤的重要生物标志物[24]。

本实验中BCP组大鼠胫骨RANK、RANKL mRNA表达升高，OPG mRNA、OPG/RANKL比值降低，提示OPG、RANK、RANKL可通过调控破骨细胞参与骨癌痛。OPG、RANK、RANKL共同构成破骨细胞分化和骨吸收的关键信号通路[25]。研究表明，在RANK过表达细胞中，金属蛋白酶基因如MMP-9和MMP-13的表达水平增加[26]。在肿瘤-骨界面，MMP-13、RANKL基因的表达上调已被识别。MMP-13表达的敲低显著减少了肿瘤-骨界面处的骨破坏和活化的破骨细胞数量[27]。在本实验中检测到BCP组大鼠MMP-13蛋白及mRNA表达升高，提示上调MMP-13的表达促进了骨癌痛的形成。而通过给予MMP-13特异性抑制剂后，MMP-13的表达受抑制，胫骨RANK、RANKL mRNA表达降低，OPG mRNA、OPG/RANKL比值升高，大鼠的机械痛阈和热痛阈明显升高。据此我们推测MMP-13可能通过下调OPG、上调RANK、RANKL表达，介导破骨细胞生成活化，从而参与骨癌痛的进展。目前已经发现许多刺激物可以诱导MMP的表达，但具体是哪些信号分子通路介导MMP-13调控骨癌痛，尚需进一步研究。