天麻素通过调控LINC01619/miR-216a-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2损伤的影响*

冀菁荃, 黄 燕, 牛晓红

长治医学院 1病理生理学教研室 2生物化学教研室，长治 046000 3长治医学院附属和济医院内分泌科，长治 046000

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的微血管并发症，以持续肾小球滤过率(GFR)降低和临床蛋白尿为特征。DN严重影响糖尿病患者的长期生存率，是终末期肾病发生的主要原因[1]。目前认为高血糖是DN发生的驱动因素，葡萄糖过度积累导致肾小管上皮细胞内葡萄糖外流，并通过多种机制促进活性氧的产生，从而加重氧化损伤和细胞凋亡[2]。因此，寻找有效策略改善肾小管损伤对遏制DN进展意义重大。天麻素(4-羟苄醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)是从天麻根茎提取的主要酚苷类物质，具有抗凋亡、抗炎、抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、神经保护等药理作用[3]。研究显示天麻素具有抗糖尿病作用，可降低糖尿病小鼠的血糖，减轻高糖对血管内皮细胞、人晶状体上皮细胞造成的损伤[4-5]。天麻素可通过上调miR-21保护大鼠心肌细胞免受缺氧损伤[6]。然而，天麻素对DN肾小管上皮细胞损伤的保护作用和机制并不清楚。人DN肾活检组织中长基因间非编码RNA 01619(LINC01619)下调，并诱导氧化应激和肾小管上皮细胞损伤，与蛋白尿增加和肾功能下降有关[7]。StarBase预测到miR-216a-5p可能是LINC01619的靶基因。miR-216a-5p可促进高糖诱导的肾小管上皮细胞纤维化[8]。然而，LINC01619是否靶向miR-216a-5p对DN肾小管上皮细胞发挥保护作用仍未可知。本研究以高糖刺激人肾小管上皮细胞HK-2构建体外DN细胞损伤模型[9]，观察从天麻提取的高纯度天麻素对高糖诱导的HK-2损伤的保护作用，并探讨其机制是否与调控LINC01619、miR-216a-5p表达有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肾小管上皮细胞系HK-2(中国科学院上海细胞库)；天麻素(纯度96.7%，批号110807-201809，中国食品药品检定研究院)；荧光素酶报告载体、空载体质粒(pcDNA)、LINC01619过表达质粒(pcDNA-LINC01619)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、针对LINC01619的小干扰RNA(si-LINC01619)(上海生工生物公司)；高容量cDNA逆转录试剂盒(美国ABI公司)；一步法荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物公司)；细胞计数试剂盒(CCK-8)(上海弗元生物)；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒(福州飞净生物公司)；丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒(北京索莱宝生物公司)；羊抗兔IgG二抗，兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl相关x蛋白(Bax)单克隆抗体(上海碧云天生物公司)。

1.2 细胞培养、转染和实验分组

HK-2细胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)的低糖(含5.5 mmol/L葡萄糖)DMEM培养液在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液孵育HK-2细胞48 h建立DN细胞损伤模型，记为高糖(HG)组；正常糖(NG)组用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液孵育HK-2细胞48 h。利用Lipofectamine 2000分别转染pcDNA、pcDNA-LINC01619、si-NC、si-LINC01619至HK-2细胞，收集转染48 h细胞进行后续实验。

为检测天麻素对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响，将HK-2细胞分为HG+天麻素低剂量组、HG+天麻素中剂量组、HG+天麻素高剂量组，即分别用含30.0 mmol/L葡萄糖、30.0 mmol/L葡萄糖+1 μmol/L天麻素、30.0 mmol/L葡萄糖+3 μmol/L天麻素和30.0 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L天麻素培养液孵育HK-2细胞48 h。

为证实天麻素是通过调控LINC01619表达对高糖诱导的HK-2损伤具有保护作用，用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液孵育转染pcDNA、转染pcDNA-LINC01619的HK-2细胞48 h，记为HG+pcDNA组、HG+pcDNA-LINC01619组；用含30.0 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L天麻素培养液孵育转染pcDNA、转染pcDNA-LINC01619的HK-2细胞48 h记为HG+天麻素高剂量+si-NC组、HG+天麻素高剂量+si-LINC01619组。

1.3 实时定量PCR(qRT-PCR)检测LINC01619和miR-216a-5p表达

按照Trizol试剂盒说明书提取各组HK-2细胞中的总RNA。采用高容量cDNA逆转录试剂盒进行cDNA转录，采用一步法荧光定量试剂盒进行qRT-PCR检测。以U6作为miR-216a-5p的内参照，GAPDH作为LINC01619的内参照，2-ΔΔCt法相对定量LINC01619和miR-216a-5p的表达。

1.4 CCK-8法检测HK-2细胞增殖活力

将转染或未转染的HK-2细胞以2×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔加入100 μL培养液。按照实验分组加入含不同浓度天麻素和(或)30.0 mmol/L葡萄糖的培养液，48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A450 nm)值以评估细胞增殖活力。

1.5 流式细胞术检测HK-2细胞凋亡率

用预冷的PBS洗涤各组HK-2细胞2次，用500 μL 1×结合缓冲液(含5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI)在暗室孵育HK-2细胞15 min，使用流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.6 试剂盒检测HK-2细胞中MDA含量、SOD和LDH活性

按照实验分组处理HK-2细胞后，分别收集细胞培养上清和细胞。使用LDH活性检测试剂盒检测培养上清中的LDH含量。同时，向含有HK-2细胞沉淀的离心管中加入1 mL提取液，超声波(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)破碎细胞，4℃、10000 r/min离心10 min收集上清液，采用MDA含量检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒检测HK-2细胞中MDA含量以及SOD活性。

1.7 蛋白质印迹法检测HK-2细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达

用预冷的PBS洗涤各组HK-2细胞2次，加入RIPA缓冲液裂解提取蛋白。二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。用12%的SDS-PAGE加载总蛋白(50 μg/孔)进行电泳，然后采用标准湿式装置转移蛋白到硝酸纤维素膜上。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后与兔抗人Bax、Bcl-2和GAPDH的一抗(1∶1000稀释)在4℃孵育过夜。随后与酶标二抗(1∶2000稀释)在室温下孵育1 h。利用增强化学发光试剂对膜上的蛋白条带进行显色反应，X线胶片曝光，Image J软件分析Bax、Bcl-2和GAPDH蛋白条带灰度值，将GAPDH作为内参，以与GAPDH灰度比值表示Bax、Bcl-2蛋白的相对表达量。

1.8 双荧光素酶报告实验验证LINC01619和miR-216a-5p的靶向关系

合成LINC01619野生型(WT)序列(包含miR-216a-5p结合位点)或LINC01619突变型(MUT)序列(与miR-216a-5p的结合位点突变)，将上述序列分别插入pmirGLO载体，构建荧光素酶报告载体WT-LINC01619、MUT-LINC01619。分别用Lipofectamine 2000试剂将这些载体与miR-216a-5p mimic或miR-NC共转染至HK-2细胞。转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定相对荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 天麻素对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响

与NG组比较，HG组HK-2细胞LINC01619表达量、细胞活力、Bcl-2蛋白表达量显著降低(均P<0.05)，miR-216a-5p表达量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高(均P<0.05)；与HG组比较，HG+天麻素中剂量组、HG+天麻素高剂量组HK-2细胞LINC01619表达量、细胞活力、Bcl-2蛋白表达量显著升高(均P<0.05)，miR-216a-5p表达量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著降低(均P<0.05)；且HG+天麻素低剂量组、HG+天麻素中剂量组、HG+天麻素高剂量组3组间上述指标差异有统计学意义(均P<0.05)。见图1和表1。

A：天麻素对高糖诱导HK-2凋亡的影响；B：天麻素对高糖诱导HK-2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响图1 天麻素对高糖诱导的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.1 The effect of gastrodin on high glucose-induced HK-2 apoptosis，Bax and Bcl-2 protein expression

表1 天麻素减轻高糖诱导的HK-2损伤Table 1 Gastrodin reduces HK-2 damage induced by high glucose

2.2 天麻素对高糖诱导的HK-2氧化应激的影响

与NG组比较，HG组HK-2细胞MDA含量、LDH活性显著增加，SOD活性显著降低(均P<0.05)；与HG组比较，HG+天麻素中剂量组、HG+天麻素高剂量组HK-2细胞MDA含量、LDH活性显著降低，SOD活性显著升高(均P<0.05)；且HG+天麻素低剂量组、HG+天麻素中剂量组、HG+天麻素高剂量组3组间上述指标差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 天麻素减轻高糖诱导的HK-2氧化应激Table 2 Gastrodin relieves HK-2 oxidative stress induced by high glucose

2.3 LINC01619对高糖诱导的HK-2损伤及氧化应激的影响

与HG+pcDNA组比较，HG+pcDNA-LINC01619组HK-2细胞LINC01619表达量、细胞活力、Bcl-2蛋白表达量、SOD活性显著升高(均P<0.05)，miR-216a-5p表达量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量、MDA含量、LDH活性显著降低(均P<0.05)。见图2、表3和表4。

A：LINC01619对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响；B：LINC01619对高糖诱导的HK-2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响图2 LINC01619对高糖诱导的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.2 The effect of LINC01619 on high glucose-induced HK-2 apoptosis，Bax and Bcl-2 protein expression

表3 LINC01619减轻高糖诱导的HK-2损伤Table 3 LINC01619 reduces HK-2 damage induced by high glucose

表4 LINC01619减轻高糖诱导的HK-2氧化应激Table 4 LINC01619 reduces HK-2 oxidative stress induced by high glucose

2.4 抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2损伤的影响

与HG+天麻素高剂量+si-NC组比较，HG+天麻素高剂量+si-LINC01619组HK-2细胞LINC01619表达量、细胞活力、Bcl-2蛋白表达量显著降低(均P<0.05)，miR-216a-5p表达量、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高(均P<0.05)。见图3和表5。

A：抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2凋亡的抑制作用；B：抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响图3 抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.3 Inhibition of LINC01619 can reverse the effect of gastrodin on high glucose-induced HK-2 apoptosis，Bax and Bcl-2 protein expression

表5 抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响Table 5 Inhibition of LINC01619 can reverse the effect of gastrodin on HK-2 injury induced by high glucose

2.5 抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2氧化应激的影响

与HG+天麻素高剂量+si-NC组比较，HG+天麻素高剂量+si-LINC01619组HK-2细胞MDA含量、LDH活性显著升高，SOD活性显著降低(均P<0.05)。见表6。

表6 抑制LINC01619可逆转天麻素对高糖诱导的HK-2氧化应激的影响Table 6 Inhibition of LINC01619 can reverse the effect of gastrodin on HK-2 oxidative stress induced by high glucose

2.6 LINC01619和miR-216a-5p靶向关系

StarBase预测显示miR-216a-5p与LINC01619序列间存在连续互补序列，见图4。双荧光素酶实验显示，与转染miR-NC比较，转染miR-216a-5p mimics显著降低WT-LINC01619的相对荧光素酶活性(P<0.05)，而对MUT-LINC01619的相对荧光素酶活性无显著影响，见表7。

图4 LINC01619和miR-216a-5p的互补序列Fig.4 Complementary sequences of LINC01619 and miR-216a-5p

表7 双荧光素酶实验

3 讨论

天麻素是中药天麻的主要活性成分，具有潜在的肝、肺、心肌和神经保护作用。天麻素可增强抗氧化酶活性，抑制炎性反应，从而改善小鼠乙醇性肝损伤[10]。天麻素还抑制活性氧生成，改变线粒体膜电位，抑制膜通透孔形成，减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡[11]。此外，天麻素通过上调miR-103表达减弱脂多糖诱导的人肺细胞损伤[12]。本研究着重探讨天麻素对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响。氧化应激和细胞凋亡是DN高血糖损伤的重要机制，持续的高糖刺激可诱导活性氧产生，当超过内源性抗氧化能力时，将导致MDA产生、LDH活性增加和细胞损伤[13]。本研究显示，高糖刺激后HK-2细胞活力、抗氧化酶SOD活性降低，而凋亡率、MDA含量、LDH活性显著增加，说明高糖可促进HK-2细胞氧化损伤和凋亡并加重DN进展。据报道，天麻素通过调节Nrf2介导的抗氧化途径可抑制肾纤维化、胶原沉积和炎症反应进而改善四氯化碳诱导的小鼠肾损伤[14]。本研究发现，天麻素可增加HK-2细胞活力，并抑制高糖诱导的氧化损伤和细胞凋亡。Bax和Bcl-2是细胞内在凋亡途径的关键介质，Bax表达增加可促进细胞凋亡，而Bcl-2表达增加则抑制细胞凋亡[15]。本研究中高糖刺激显著上调Bax表达，下调Bcl-2表达，而天麻素处理显著逆转上述改变，与天麻素的抗凋亡作用吻合。以上研究表明，天麻素通过抗氧化和抗凋亡机制对高糖诱导的HK-2损伤具有保护作用。

lncRNA和miRNA是高度保守的非编码转录本，lncRNA通过结合特异性miRNA并抑制其活性，在多种细胞过程中起调控作用[16]。既往研究证实天麻素可调控lncRNA和(或)miRNA表达进而发挥保护作用，例如天麻素和钩藤碱联用通过上调miR-21-5p和miR-331-5p表达从而抑制缺血诱导的炎性小体活化，发挥神经保护作用[17]。Shu等[18]证实lncRNA Gm7237/miR-142a轴是天麻素介导中枢神经系统髓鞘化的关键通路。本研究显示，天麻素处理显著逆转高糖刺激对LINC01619表达的抑制和对miR-216a-5p表达的促进作用，提示天麻素对高糖诱导HK-2细胞损伤保护作用与调控LINC01619和miR-216a-5p表达有关。功能验证表明，过表达LINC01619显著抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和氧化损伤，下调Bax表达，上调Bcl-2表达，并增加细胞活力。有研究证实DN患者肾组织中miR-216a-5p表达增加并促进系膜细胞增殖和高糖诱导的HK-2细胞纤维化[19]。本研究证实miR-216a-5p与LINC01619序列间直接结合，提示HK-2细胞中存在LINC01619/miR-216a-5p调控通路。深入分析发现，干扰LINC01619表达显著减弱天麻素对高糖诱导的HK-2细胞凋亡和氧化损伤的保护作用，这说明天麻素可能通过调控LINC01619/miR-216a-5p途径进而对高糖诱导的HK-2损伤发挥保护作用。

本研究中，天麻素体外研究的剂量分别为1、3和10 μmol/L，选择该浓度主要参考了天麻素对细胞相关蛋白或通路影响的文献，如杨永利等[20]探究5～20 μmol/L天麻素对高糖诱导的RF/6A细胞增殖、迁移、凋亡及SIRT1/TLR4表达水平的影响；尹秀萍等[21]研究1 μmol/L及5 μmol/L天麻素调控Nrf2/Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)信号通路促进成骨细胞分化和抑制骨质疏松。由此可见，1～20 μmol/L是多数研究者选择的天麻素剂量范围。

进一步，本课题考察了天麻素通过调控LINC01619/miR-216a-5p通路，减弱高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化损伤，该结果提示了天麻用于治疗DN的可能分子机制。是否能从本研究外推至酚苷类物质具有调控LINC01619/miR-216a-5p通路及治疗DN的作用尚无明确证据，但该假设也引出一个问题，天麻素调控LINC01619/miR-216a-5p通路的机制是否与天麻素的酚苷类化合物共有的化学结构相关，这一点仍需要进行深入研究。本研究为体外研究，在体内是否也存在类似的机制还有待于进一步通过动物实验甚至临床研究进行验证。

总之，天麻素能够减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2凋亡和氧化损伤，其机制可能与调控LINC01619/miR-216a-5p通路有关，这进一步揭示了天麻素的保护作用机制，为天麻素用于遏制DN进展提供了理论依据。