Rab20在结直肠癌中高表达并调控结直肠肿瘤细胞的增殖与干性*

张国飞，胡大迁，覃吉超，李阳坤

华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科，武汉 430030

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是人类消化系统常见的恶性肿瘤之一，而且发病率呈上升趋势[1-2]。尽管结直肠癌的早期诊断与联合治疗取得一定的进展，但其预后仍不理想[3]。因此深入探究结直肠癌发生发展机制，对治疗结直肠癌有极大帮助。Ras信号通路失调是癌症常见表现[4]，Rab20蛋白是Ras蛋白家族(Ras，Rho/Rac/Cdc42，Ran，Sar/Arf，Rab)的成员之一，调控细胞物质转运，参与胞吞胞吐、核内体形成、囊泡的形成和运输等过程[5-7]，并在肿瘤的发生发展中起重要作用[8-9]，然而目前Rab20在结直肠癌发生发展中的作用尚不清楚。本研究分析了Rab20在结直肠肿瘤组织及正常组织的表达，探讨Rab20对结直肠癌细胞增殖及干性的影响，并进一步揭示可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人结直肠癌细胞SW620细胞系购自中国科学院细胞库，人正常结直肠上皮细胞由正常结直肠原代组织分离，XhCRC细胞由人结直肠癌移植瘤模型分离[10]。DMEM、DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清(FBS)、细胞因子B27、牛血清蛋白(BSA)、人重组表皮生长因子(hEGF)购自美国Gibco公司，外源Wnt3a蛋白、CCK-8试剂购自美国MCE公司，psPAX2、pMD2G、pLKO.1-NC和pLKO.1-shRab20质粒购自武汉奥科生物有限公司；ts045-VSVG-EGFP质粒购自美国Addgene生物有限公司，Western blot试剂购自上海碧云天公司，BCA试剂盒及Turbofect转染试剂购自美国Thermo Fisher公司，抗体β-actin、GAPDH、Rab20购自武汉ABclonal生物有限公司，抗体β-catenin、Cyclin D1购自美国Cell Signaling Technology公司，抗体8G5F11购自美国Kerafast公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠抗体购自武汉启动子生物有限公司。

1.2 病毒包装与敲减细胞系的构建

对数生长期的293T细胞接种于6孔板，达到70%～80%的细胞密度后，使用Turbofect转染试剂，将pLKO.1-NC/shRab20∶psPAX2∶pMD2G按2∶2∶1混合，每孔加5 μg质粒，转染6孔板细胞，8 h后更换新鲜培养液，40 h后收集含有病毒的细胞上清。对数生长期的XhCRC细胞、SW620细胞接种于12孔板，达到30%～50%的细胞密度后，加入400～800 μL含病毒上清，24 h后更换新鲜培养液，40 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素筛选成功转染的细胞，并使用Western blot验证。

1.3 结直肠癌细胞囊泡运输检测

使用Turbofect转染试剂，将2 μg的ts045-VSVG-EGFP质粒转染于6孔板内对数生长期的XhCRC细胞、SW620细胞，8 h后更换新鲜培养液，并置于含5%CO2、40℃的细胞培养箱中继续培养36 h，使ts045-VSVG-EGFP在细胞中表达并滞留于内质网中，随后将细胞换至含5%CO2、32℃的细胞培养箱培养，使ts045-VSVG-EGFP由内质网开始向细胞膜运输[11]，继续培养45 min后，使用4%多聚甲醛固定，加入抗体8G5F11特异性识别细胞膜表面蛋白VSVG，使用荧光显微镜进行检测。

1.4 结直肠癌细胞增殖能力检测

对数生长期的实验组和对照组细胞按照2×103个/100 μL标准接种96孔板，分别培养0、24、48、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，继续孵育2 h后，用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度值，绘制细胞增殖曲线，纵坐标为相对吸光度，横坐标为时间。

1.5 结直肠癌细胞球体形成能力检测

对数生长期的XhCRC细胞、SW620细胞以5000个/孔接种于24孔超低吸附板中，加入干细胞培养液，于含5%CO2、37℃的细胞培养箱继续培养5～7 d，显微镜下观察并记录直径≥50 μm的细胞球体个数，计算细胞球体形成率。

1.6 Western blot检测

处理后的细胞，加入NP40裂解液充分裂解，提取蛋白质，经BCA试剂定量检测，通过SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，先后加入相应一抗于4℃孵育过夜、二抗于室温孵育1 h后，曝光显影。

1.7 基于生物信息学分析Rab20在结直肠癌组织的表达

使用TIMER2(http：//timer.cistrome.org/)和GEPIA2(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)数据库分析Rab20在结直肠癌及正常组织的表达差异，设定阈值log2FC=1，P<0.01，纳入数据库中正常结直肠组织与结直肠癌组织数据即可得到基因表达图。

1.8 Rab20相关基因富集分析

使用STRING(https：//string-db.org/)数据库对Rab20蛋白进行分析，设定阈值最低交互分数为0.150，并选择数据来源为已发表文献，且得到经实验验证的与Rab20相结合的蛋白。使用GEPIA2(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)数据库进行相关基因检测，根据TCGA数据库肿瘤组织和正常组织的数据，获得与Rab20表达相关的基因。结合两组数据，使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库对Rab20相关基因进行京都基因与基因组百科全书信号途径分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体富集分析(the Gene Ontology，GO)。统计偏差的截止标准为P<0.05。

1.9 统计学方法

所有实验均独立并重复进行3次。使用SPSS 20.0统计软件对各组所得的数据进行分析，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Rab20在人结直肠肿瘤组织及细胞系中高表达

TIMER2和GEPIA2数据库分析结果显示结直肠肿瘤组织中Rab20含量高于邻近正常组织(图1A、1B)。Western blot检测显示结直肠癌细胞系SW620和XhCRC细胞中Rab20的表达水平显著高于人正常肠上皮细胞(图1C)。为进一步验证Rab20蛋白在结直肠癌发生发展中的作用，对XhCRC细胞和SW620细胞Rab20基因进行敲减，shRab20组细胞的Rab20表达量显著低于对照shNC组细胞(图1D)，提示敲减成功，可以进行后续实验。

A：TIMER2分析Rab20在直肠癌(READ)中的表达，*P<0.05；B：GEPIA2分析Rab20在结肠癌(COAD)中的表达，**P<0.01；C：Western blot检测Rab20的表达，Nor为人正常结直肠黏膜上皮细胞；D：Western blot验证Rab20的敲减图1 Rab20在人结直肠肿瘤组织及结直肠癌细胞系中的表达Fig.1 The expression of Rab20 in human colorectal tumor tissues and cell lines

2.2 Rab20相关基因的富集分析

为分析Rab20在结直肠癌中的相关作用，筛选出Rab20结合蛋白与Rab20表达相关基因进行富集分析。基于STRING工具，获得10个经实验验证的Rab20结合蛋白(图2A)。利用GEPIA2工具结合TCGA的肿瘤表达数据，得到了与Rab20基因表达相关的64个基因，分析显示，在大多数癌症类型中，Rab20基因的表达与FCGRT、FUCA1、MVP、PRR13和TNFSF13等基因呈正相关(图2B)。结合这两组数据进行KEGG(图2C)和GO(图2D)分析，表明Rab20与细胞抗原加工呈递、移植物抗宿主反应等通路有关，与细胞囊泡、细胞内吞、物质运输等生物学行为密切相关。

A：STRING数据库分析Rab20结合蛋白；B：GEPIA2数据库分析Rab20相关基因，Rab20的表达与FCGRT、FUCA1、MVP、PRR13和TNFSF13基因呈正相关；C：Rab20相关基因的KEGG分析；D：Rab20相关基因的GO分析图2 Rab20相关基因富集分析Fig.2 Gene set enrichment analysis of Rab20-related genes

2.3 Rab20调控结直肠癌细胞的囊泡运输

进一步验证Rab20在结直肠癌细胞囊泡运输中的作用，分别在XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20细胞中转染ts045-VSVG-EGFP质粒，使用8G5F11抗体识别运输至细胞膜表面的VSVG蛋白，通过追踪VSVG荧光蛋白位置及细胞膜表面分布，示踪囊泡运输[11]。荧光显微镜观察(图3A)，并计算细胞膜表面VSVG/总VSVG比值(图3B)。结果显示，敲减Rab20显著抑制XhCRC细胞的囊泡运输功能。

A：免疫荧光检测XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20细胞的囊泡运输能力(比例尺为50μm)；B：统计0 min和45 min时，细胞膜表面VSVG/总VSVG比值；与shNC组比较，**P<0.01图3 Rab20敲减对XhCRC细胞囊泡运输的影响Fig.3 Effect of Rab20 knockdown on the vesicle traffic of XhCRC cells

2.4 敲减Rab20抑制结直肠癌细胞的增殖与干性

为探讨Rab20与结直肠癌细胞增殖及干性表型的关系，分别在XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20细胞中进行CCK-8实验和细胞球体形成实验。CCK-8实验结果显示在48 h和72 h后，shRab20组细胞增殖能力显著低于shNC组(图4A)。球体形成实验表明，shRab20组细胞球体形成数量显著低于shNC组，细胞球体形成率显著降低(图4B)。提示敲减Rab20能够抑制结直肠癌细胞增殖与干性。

A：细胞增殖曲线；B：细胞球体形成实验(比例尺为200 μm)；与shNC组比较，**P<0.01图4 Rab20敲减对XhCRC细胞增殖和干性的影响Fig.4 Effect of Rab20 knockdown on proliferation and stemness of XhCRC cells

2.5 Rab20抑制结直肠癌细胞的增殖与干性的机制

Western blot检测结果显示，Rab20敲减后，β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达显著降低，提示Rab20可能调控Wnt通路影响结直肠癌细胞；加入外源Wnt3a蛋白后，能够明显逆转降低的β-catenin、Cyclin D1蛋白表达(图5)。

与shNC组比较，*P<0.05，**P<0.01；与shRab20组比较，##P<0.01图5 Rab20敲减及外源性Wnt3a处理对XhCRC细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响Fig.5 Effect of Rab20 knockdown and Wnt3a on Wnt/β-catenin pathway in XhCRC cells

同时外源Wnt3a蛋白处理shRab20组细胞后，CCK-8实验和细胞球体形成实验结果显示敲减Rab20抑制结直肠癌细胞增殖与干性的作用被显著逆转(图6)。以上结果提示Rab20可能通过调控Wnt/β-catenin通路，影响结直肠癌细胞的增殖与干性。

A：细胞增殖曲线；B：细胞球体形成实验(比例尺为200 μm)；与shNC组比较，**P<0.01；与shRab20组比较，##P<0.01图6 外源性Wnt3a处理对敲减Rab20后XhCRC细胞增殖和干性的影响Fig.6 Effect of Wnt3a on proliferation and stemness of Rab20-knockdown XhCRC cells

3 讨论

结直肠癌是临床常见的肿瘤，在全世界范围表现出较高的发病率与死亡率[12]。目前结直肠癌的诊疗逐步完善，然而仍有较大部分患者出现不良结局[2-3]。因此，测定结直肠癌发生发展的标志细胞因子，研究其可能的作用机制，对结直肠癌的诊断与治疗极为重要。

Rab蛋白是高度保守的囊泡运输调控因子，通过结合GFP与下游网格蛋白和细胞骨架相互作用，触发细胞的物质运输[13]，并参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、代谢和分泌等过程[14]。Rab20是Rab家族成员，在胰腺癌、阴茎鳞癌、膀胱癌等多种实体瘤中高表达，促进肿瘤细胞增殖[15-18]，在肝细胞癌中Rab20调控肝癌细胞外泌体分泌，调控肝癌发生[19]。Rab20基因在结直肠腺瘤中高度扩增，与结肠腺瘤复发和不良结局相关[8]。然而Rab20在结直肠癌中的作用尚不清楚。本研究发现Rab20在结直肠癌组织与细胞中的表达显著高于正常结直肠组织与上皮细胞。基因富集分析发现Rab20与胞吞胞吐、囊泡运输和核内体形成等生物过程密切相关。进一步敲减Rab20，实验组XhCRC细胞的囊泡运输能力明显受损，表明Rab20具有促进结直肠癌细胞囊泡运输的作用。

Wnt信号通路的异常活化是癌症常见表现[20]，其中Wnt配体通过自分泌或旁分泌发挥作用，激活Wnt/β-catenin通路，调控肿瘤干性、增殖、侵袭、转移等过程[21]。基于Rab20在细胞囊泡运输与分泌中的作用，我们的研究进一步探讨了Rab20对Wnt信号通路的影响。敲减Rab20后，实验组XhCRC细胞增殖能力和细胞球体形成能力显著低于对照组细胞，提示Rab20具有增强结直肠癌细胞增殖及干性的作用。敲减Rab20组细胞β-catenin、Cyclin D1表达水平明显降低，而加入外源Wnt3a处理能显著抵消降低效果。外源Wnt3a处理敲减Rab20组细胞，能显著逆转敲减Rab20对结直肠癌细胞增殖及干性的抑制作用。上述结果表明，Rab20在结直肠癌中高表达，调控囊泡运输功能，并可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路增强结直肠癌细胞的增殖和干性。