水产品中生物活性肽的研究进展

◎ 张龙翼，张鹏程，陈秋月，彭海川，钱 琴，王林果，贾溅琳，张 崟

（成都大学，四川 成都 610106）

生物活性肽的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是一种蛋白质片段。一旦从原始蛋白质中释放出来，就会表现出不同的功能[1]。肽表现出的不同生物活性取决于它们的结构、组成和序列[2]。目前，生物活性肽表现出的抗氧化、抗癌、抗高血压和抗菌等特性，使其受到了研究者的广泛关注[3]。2019 BIOPEPUWM生物活性肽（前身为BIOPEP）数据库显示，现在已经发现并报道了至少4 300多种生物活性肽，可以根据它们表现出的不同生物活性对其进行分类，例如可将其分为抗菌肽、抗高血压肽、免疫调节肽、抗氧化肽和呈味肽等[4]。

海洋面积约占地球表面积的70%，为人们提供了大量的生物资源，其丰富的鱼类资源、甲壳类资源、软体类动物资源等为人们提供了丰富的生物活性肽来源。水产品是人类重要的食物来源，在食物结构中占据重要的地位，据统计，2019年全国水产品总产量为6 480.36万t[5]。目前，国内外许多研究人员已从水产品及其副产品中提取出了具有各种功能的生物活性肽，例如WANG等[6]通过蛋白酶从鲢鱼中提取出了抗氧化肽；宋茹[7]以黄鲫为原料，利用蛋白酶制备出了抗菌肽。本文简述了水产品及其副产品中生物活性肽的制备、分离纯化、鉴定以及其功能活性，为进一步研究水产品中的生物活性肽提供一定的理论基础。

1 水产品中生物活性肽的制备

水产品中生物活性肽的制备一般是通过蛋白质降解的方法，其主要包括化学法水解和酶水解。

1.1 化学法水解

化学法水解是一种较为传统的水解蛋白质的方法，主要有酸水解法和碱水解法。其原理就是通过一定的酸或碱与蛋白质的肽键发生反应，从而制备出一些具有活性的多肽。虽然化学法水解的成本低、操作简单，但反应条件剧烈，容易造成环境污染，且会破坏氨基酸而不利于多肽活性的维持[8]。酸水解快速且彻底，会形成大量游离氨基酸和少量小肽，主要用于生产调味品。碱水解时，易与精氨酸、丝氨酸等氨基酸发生作用，从而导致营养成分流失[9]。

1.2 酶水解法

酶水解法就是利用胰酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶等蛋白水解酶从鱼肉蛋白中得到相应的多肽，目前采用的酶解法一般有单酶水解法和两种及以上蛋白酶的复合酶解法。张崟等[10]对采用酶解技术从畜禽及水产品加工副产物中制备肽进行了综述。但酶水解法与蛋白酶的选择、水解时间以及温度有关，不同的条件会对水解的程度造成不同的影响，从而影响生成肽的类型[11]。表1为不同蛋白酶在水产品中适宜的反应条件，但是目前还没有已知的产生特定生物活性肽的特定酶[12]。与化学水解法相比，酶解法更加方便快捷、环保无污染、高效安全，随着我国对环保问题的重视，酶解法也必将得到广泛的应用[13]。

表1 不同蛋白酶在水产品中适宜的反应条件表

2 水产品中生物活性肽的分离纯化

水产品中通过蛋白质降解法提取出来的多肽量少且杂质较多。而通过分离纯化后，提取出来的多肽具有较高的生物活性与纯度。目前水产品中生物活性肽的提取方法主要有超滤、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱和反相高效液相色谱技术[14]。

2.1 超滤技术

超滤技术是纳米级薄膜分离技术，以薄膜两侧的压力差为驱动力，使溶液通过滤膜孔径时能够达到分离、提纯、浓缩的目的。超滤法操作简单，目前已广泛应用于水产品中肽的研究，如陈思谨[15]通过使用超滤技术从红鼓鱼鱼鳞酶解液中分离得到了纯度达95%的红鼓鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白。超滤技术是一种高新技术，具有高效、低能耗、效果稳定以及无污染的优点，但是这种技术只适用于初步分离肽，而不能分离得到具体的某一种肽[16]。

2.2 凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法也就是分子排阻色谱法。其主要原理是利用凝胶作用将分离物质按照不同的分子大小进行分离，从而达到分离纯化的目的。该方法所使用的凝胶是一种惰性载体，不带电荷，分离效果好。且该方法在分离过程中不需要有机溶剂，所以产物不易变性。但该方法一般需要结合其他分离纯化方法一起使用，才能得到更高活性、更高纯度的多肽[17]。凝胶层析主要应用于蛋白质相对分子量的测定及其分离纯化，也逐渐应用于水产及其副产物的蛋白酶解分离[18]。陈宏[19]将样品上样于超纯水平衡好的Sephadex G-15凝胶柱（1.5 cm×100 cm），测定出了牡蛎样品中各组分中多肽的浓度以及各组分对DPP-IV的IC50值。

2.3 离子交换色谱法

离子交换色谱法是指利用固定相中的带电基团与蛋白质、多肽分子带电基团不同，在一定酸碱条件下，不同带电基团与固定相和流动相的结合力不同，使得固定相上带电物质与流动相中的离子发生交换[20]。目前离子交换色谱在水产品及其副产品中运用也较广泛，例如BARBARA等[21]用离子交换色谱法分析鳕鱼片中添加的磷酸盐，结果发现IMP和ADP分别影响三偏磷酸盐和二磷酸盐的定量。

2.4 反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱是目前水产品分离纯化多肽较常用的方法，是将极性流动相与非极性固定相组成一种液相色谱体系。主要原理是利用流动相极性的变化，非极性的固定相与非极性的多肽分子的结合效果减弱，使得溶质分子脱离纯化[22]。例如，HU等[23]在Zorbax SB-C18柱上使用反相高效液相色谱进一步纯化凝胶过滤色谱分离后抗氧化活性最高的成分，得到对DPPH自由基清除活性最高的B3成分（P＜0.05）。

3 水产品中生物活性肽的鉴定

通常采用质谱技术、电泳技术以及多种仪器联用等技术来鉴定水产品及其副产物中分离纯化后的生物活性肽。质谱法（Mass Spectrometry，MS）是通过质谱仪将多肽分解为不同质荷比的离子，再利用电场和磁场将不同质荷比的离子分开。质谱分析具有分离效果好、灵敏度高、准确度高的优点，一般能与其他仪器联用，如电喷雾电离质谱、液相色谱-串联质谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱等。

电泳技术是根据多肽和蛋白质的相对分子质量以及等电点的不同进行鉴定的方法。电泳法操作简单，可以快速得到多肽的大概信息，但只能了解到多肽的相对分子质量以及等电点，不能得到多肽的具体序列，因此无法应用在新生物活性肽的鉴定方面。

4 水产品中生物活性肽的功能活性

4.1 抗氧化性

在日常生活中，人的机体内会不可避免的产生自由基，这些自由基会与体内的一些生物大分子发生反应而产生氧化物。有研究表明，癌症、衰老、糖尿病等与过量自由基的产生有关[24]。抗氧化肽是一种能够减缓或者抑制自由基发生氧化反应的物质，尹天旸[25]从草鱼酶解液中制备出了抗氧化肽（WEPH），浓度为1 mg·mL-1时，对DPPH自由基的清除率能够达到73.52%，表现出良好的抗氧化活性。

4.2 抗菌性

抗菌肽具有抗细菌、真菌、病毒等作用，能够促进伤口愈合，增强免疫功能。水产品及其副产物可以为人们提供丰富的生物活性肽资源，从中可以得到多种抗菌肽。王焙等[26]通过酸性蛋白酶从鲣鱼暗色肉酶解液中制备了抗菌肽，并发现其对大肠杆菌具有较好的抑菌效果，抑菌率为（79.56±1.56）%。抗菌肽因具有极高的抗菌活性，目前已被广泛应用在生物医药以及食品领域。

4.3 降高血压

降血压肽的作用原理是通过抑制血管紧张素转换酶的活性，使血管紧张素Ⅰ不能转变为血管紧张素Ⅱ，从而达到降血压的目的。降血压肽安全无副作用，目前已被广泛应用于高血压治疗上。LIN等[27]通过复合蛋白酶水解军曹鱼皮，所得水解产物（PX-5）对ACE的IC50为0.221 mg·mL-1，其中显示出降高血压活性的4种肽的氨基酸序列分别为Trp-Ala-Ala、Ala-Trp-Trp、Ile-Trp-Trp和Trp-Leu。

4.4 其他功能活性

生物活性肽除了具有抗氧化性、抗菌性和降血压的功能外，还具有其他的功能活性。例如，HARNEDY等[28]从大西洋鲑鱼副产物的蛋白质水解物中提取出了具有抗糖尿病作用的肽；HOU等[29]从南极磷虾蛋白水解物中提取出了一种可以促进人体钙吸收的钙螯合肽（Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg）。

5 结语

水产品包含淡水和海洋中的鱼类、甲壳类、软体类及其加工的产品，资源丰富，因此水产品中的生物活性肽具有丰富的来源和多样性。本文简述了水产品中生物活性肽的制备、分离纯化、鉴定方法以及其功能活性，发现目前对于水产品中生物活性肽的研究还存在以下几方面不足。①对于目前所研究出来的生物活性肽大多数只是在小鼠上进行生物活性实验和体外实验，但还缺乏一定的临床应用。②大多数研究都还只是理论研究，缺乏实际应用。③研究领域不平衡，大多数研究集中在对水产品中抗氧化肽的研究，对其他方面的研究较少，如对抗疲劳肽的研究。此外，研究的水产品种类不够丰富，还有许多水产种类还需要相关学者去研究。随着研究的深入，相信这些问题在未来会得到解决。