PTPN12低表达参与调控肺癌H1299细胞凋亡的作用及对放疗敏感性的影响

张 凯 刘培培 张 松 杨 峥 饶石磊 齐书然 余 杰 王 旸

肺癌在临床治疗中通常采用外科手术、放射疗法和化学疗法等综合措施，但各种报道显示，即使在早期进行根治性手术患者5年生存率也相对不高。随着肿瘤分子流行病学的学科发展，研究者们发现了多种与肺癌淋巴结转移、组织侵袭相关的肿瘤标志物。肺癌患者死亡的主要原因是癌细胞的侵袭和转移，细胞外基质降解，肿瘤细胞的粘附和迁移，血管生成和淋巴浸润在肺癌转移中起着重要作用。 在临床上，肺癌转移机理的研究得到了高度重视[1-2]。PTPN12作为细胞粘附分子选择素家族的成员之一，仅在内皮细胞被某些刺激激活时才表达，并且与肿瘤细胞转移密切相关[3-4]。研究提示，PTPN12参与细胞信号转导过程，并且在许多良性或恶性肿瘤疾病中可以观察到血清水平的变化[5-6]。本文将针对PTPN12低表达参与调控肺癌H1299细胞凋亡的作用进行研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料

研究纳入临床患者为2019年1月至2020年12月我院收治的肺癌患者，样本量为82例，收集受试对象相关资料以备分析讨论。纳入标准：经病理学明确诊断，且为首发肺癌的受试对象；具有放化疗等综合治疗措施适应证的确诊患者；预计生存时间高于6个月；患者能配合研究始终。排除标准：合并冠心病、糖尿病等疾患的受试对象；并发其他恶性肿瘤的受试对象；对于本研究中包含的治疗方案不能耐受，或拒绝接受治疗的患者；术后并发症严重的患者。本次研究共纳入男性45例，女性37例；年龄41～82岁，平均年龄(64.34±10.75)岁；其中包含肺鳞癌患者33例，肺腺癌49例；肿瘤分期情况(TNM):Ⅰ期16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期22例，Ⅳ期14例；既往有吸烟史48例。

1.2 方法

1.2.1 PTPN12-mRNA及蛋白表达的测定与分析 通过western blot实验分析PTPN12-mRNA表达特征；同时对蛋白表达进行测定。

1.2.2 PTPN12基因突变 提取DNA：使用10%中性福尔马林对标本固定完成进行石蜡包埋，病理切片采用HE染色，出血坏死部位在观察过程中尽量避开，从石蜡包埋块中取出直径为0.5 cm的组织块，肿瘤组织集中并重新涂抹石蜡，嵌入5 μm厚的连续切片(共6个切片)。 QIAamp DNA FFPE组织试剂盒用于从样品中提取DNA。研究使用的分光光度计为NanoDrop 1000型，用于确定样品中DNA的浓度和纯度。用紫外分光光度计检测提取的DNA，以进行浓度检测和质量评估。在DNA浓度介于1.8至2.0之间后，将DNA浓度稀释至2.0 ng/μL，并为每批样品添加阴性和阳性对照，以确保测试质量。

进行PCR检测及测序分析：本研究中相关试剂盒购自厦门艾德公司。通过聚合酶链反应(PCR)测序方法和电泳毛细管(ABI 3130XL)检测样品PTPN12基因外显子18～21中的突变。该检测试剂盒采用八链PCR试管设计，该试管配备了PTPN12突变检测试剂和相应的质量控制试剂。在检测过程中，将42.3 μL模板DNA和2.7 μL Taq酶混合，并添加5 μL上述相应的试管混合物以形成PCR反应系统。反应条件：95 ℃ 5 min，1个循环； 95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环； 93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环。在延伸期间在60 ℃收集信号。通过琼脂糖凝胶电泳(western blot)鉴定PCR产物后，通过核酸外切酶和热敏磷酸酶去除引物和dNTPs，并对纯化的PCR产物进行PCR测序，反应条件为：纯化的PCR产物(10 ng/μL)1 μL， BigDye(2.5×)8 μL，引物3.2 pmoL/μL，10 μL去离子水，测序引物用NaAc和乙醇纯化，然后进行双向测序。使用的仪器是ABI7500实时荧光定量PCR仪器，并通过相关软件分析了测序结果。

研究中相关结果判读：突变Ct值≥阴性临界值29时，判定阴性，突变Ct值<阳性临界值26时为强阳性(26～29之间为弱阳性)。western blot法完成扩增产物等蛋白的定性和定量分析：电泳后从玻璃板上剥离凝胶，将其放入沸腾的凝胶盒中，加入25%的乙醇直至乙醇浸透凝胶表面。将胶盒放入微波炉中，在高温下煮2.5 min，重复此步骤3次；随后，加入考马斯亮蓝染色液(直到染色液浸入凝胶表面)，然后将其放在室温下的摇床上缓慢旋转30 min，直到清晰可见凝胶带为止；第三步，用ddH2O冲洗染色的凝胶后，加入5%的乙酸和25%的乙醇的混合物，并缓慢摇晃漂白摇床约1 h，直到染色液基本洗脱出来。最后，变色完成后用ddH2O冲洗凝胶，将其放置在凝胶图像扫描分析仪中，并在使用成像软件处理后拍摄并保存照片。

1.2.3 血清肿瘤标志水平测定 采用化学发光法检测外周血血清肿瘤标志物[糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)]，检测时严格依据试剂盒说明书进行操作。参考区间：CA125 0～25.0 U/mL，CEA 0～5.0 μg/L，NSE 0～15.0 ng/mL，SCC-Ag 0～1.5 μg/L，CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，TSGF 0～64 ng/mL。

1.2.4 放疗敏感性分析 采用0 Gy、2 Gy、4 Gy的γ射线照射PTPN12不同表达的肿瘤细胞NCI-H446；通过MTS实验、集落形成实验对肿瘤细胞的增殖情况进行测定，分析PTPN12对肿瘤放疗敏感性的影响。

1.3 统计学处理

采用描述性统计学指标(均数、标准差、中位数、四分位间距、极差、率、构成比、相对比等)对研究结果中的一般资料进行统计学描述；对服从正态分布的计量资料采用两独立样本t检验或单因素方差分析进行组间资料的比较，对不服从正态分布的计量资料采用两组或多组资料的秩和检验，进行组间资料的比较；采用χ2检验进行率的比较；依据数据是否服从二元正态分别采用pearson或spearman法进行相关分析；无特殊说明情况下显著性水平ɑ=0.05，所有P值表示双侧概率。

2 结果

2.1 PTPN12表达对肺癌病情的调控作用分析

PTPN12表达对肺癌病情的调控作用分析结果可见，在组织分化和病理分期更严重的患者中PTPN12-mRNA表达更低，且在随访生存期更低的患者中也可见表达更低，均有统计学意义，如表1所示。但PTPN12蛋白表达只在不同病理分期患者中检出差别有统计学意义，且同mRNA表达规律相一致；而在不同组织分化和预后患者间差别尚未见统计学意义，与样本量等因素限制有关，见表1。

表1 PTPN12表达与肺癌病情预后的关联分析

研究还对PTPN12基因突变检测结果进行了进一步分析，NSCLC患者癌组织标本PTPN12基因突变的检测结果显示，外显子19突变21例、外显子21突变17例，无外显子19与外显子21的双突变。见表2、图1。

注：1a：19外显子缺失突变，1b与1c：21外显子点突变。

表2 PTPN12基因突变特点

与此同时，PTPN12基因突变与PTPN12基因野生型患者血清肿瘤标志物水平比较，结果发现PTPN12基因突变者血清CEA高于PTPN12基因野生型患者，而CA125、CYFRA21-1低于PTPN12基因野生型患者，两者SCC-Ag、NSE、TSGF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 PTPN12基因突变与PTPN12基因野生型患者血清肿瘤标志物水平比较

采用PCR法扩增PTPN12-mRNA片段，并采用Western blot检测受试者血清中PTPN12-mRNA表达特征，结果显示，PTPN12突变型组织样本组在592 bp左右位置处可见清晰条带(group1～group5)，而 PTPN12野生型样本组(group6)及DNA marker组(group7)基本无条带，表明PTPN12-mRNA在细胞肺癌患者中发生特异性表达的理论依据成立。详见图2。

注：1～5:PTPN12突变型组织样本；6:PTPN12野生型样本；7:DNA marker。

2.2 PTPN12表达调控肺癌H1299细胞凋亡及对患者放疗敏感性的影响作用

PCR以及Western blot检测结果提示PTPN12的mRNA水平及其蛋白质表达水平无论高低与否，转染 shRNA PTPN12进行基因下调的H1299细胞均可见PTPN12的表达下降(P<0.05)，详见表4和图3所示。转染后H1299-shGFP 及H1299-shPTPN12细胞对放疗不同剂量照射(0、2、4、6、 8 Gy)敏感性不一，通过建立两组细胞生存曲线并进行分析，可见H1299-shGFP及H1299-shPTPN12细胞的DO值、Dq值以及 SF2值分别(3.01 Gy、3.42 Gy、0.92及1.83 Gy、2.42 Gy、0.70)差别有统计学意义(P<0.05)；详见图4所示。另外进一步以PTPN12表达为二分类自变量，参考其他潜在影响患者放疗敏感性的因素(年龄、性别、肿瘤组织分化情况、肿瘤分期情况)，进行多因素回归分析，也提示PTPN12表达是独立影响放疗敏感性的因素，OR值为3.404(95%CI 1.258～9.254)，P<0.05。

表4 PTPN12基因表达变化对H1299的转染存活的影响分析

图3 PTPN12基因表达变化对H1299存活影响PCR结果图

图4 PTPN12基因表达对H1299放疗敏感性的影响分析

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移程度决定了肺癌患者的预后。 肿瘤细胞通过与白细胞的粘附激活相关的肿瘤信号通路，积聚在血管中或穿透血管壁。这个过程涉及许多粘附分子，其功能是帮助肿瘤细胞识别靶器官的血管内皮细胞[7]。PTPN12是表达于内皮细胞和肿瘤血管内皮细胞，激活相关的信号通路分泌粘附分子选择素，研究证实，其表达在癌周组织的血管内皮细胞中呈现高表达，与肿瘤的侵袭和转移存在关联性[8]。PTPN12可直接介导肿瘤细胞与血管内皮的黏附，同时与肿瘤细胞表达的选择素配体具有相互识别的功能，可增加肿瘤转移的概率[9]。有研究提示，血清PTPN12浓度的升高可能会增强血管内皮对肿瘤细胞的摄取能力，也有可能作为促进肿瘤转移的信号分子[10]。PTPN12作为免疫球蛋白黏附因子之一，在多种细胞膜表面均可表达，发挥着抗原识别、呈递以及淋巴细胞杀伤等功用[11]。既往研究结果证实[12]，恶性肿瘤患者体内肿瘤细胞会过度表达PTPN12，一方面增加已转移肿瘤细胞的黏附性，另一方面促进特异性蛋白酶水解，增加血清中PTPN12浓度，使肿瘤细胞逃脱细胞免疫监视。

本研究患者癌组织标本检出PTPN12基因突变，发生率为37.50%，与其他相关研究报道的NSCLC患者PTPN12突变率38.8%的结果相近，结果表明，NSCLC患者的PTPN12突变主要集中在外显子19缺失和外显子21点突变，外显子19突变主要是746至750位密码子缺失突变，产生相应的氨基酸序列[13]。PTPN12是跨膜糖蛋白。在NSCLC中，PTPN12高度表达，并且PTPN12基因突变后DNA或基因中的单个碱基对变化可以增加PTPN12对三磷酸腺苷(ATP)的亲和力，并增加NSCLC患者的酪氨酸激酶活性。靶向酪氨酸临床实践中使用的激酶抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼优先结合突变蛋白PTPN12的ATP来取代ATP，然后抑制磷酸化和下游信号通路的活化，因此其功效与PTPN12突变[14]。目前多数NSCLC患者在初诊时已达晚期，无法获得足够的肿瘤组织进行PTPN12基因突变检测，分析PTPN12突变患者临床特征有积极意义[15]。外周血循环肿瘤DNA为一种主要来自肿瘤组织，因肿瘤细胞坏死脱落，能较好体现肿瘤遗传基因的特征，因而监测肿瘤标志物水平可能对推断PTPN12突变有益。

总之，PTPN12低表达同肺癌患者的放射敏感性存在关联，PTPN12下调可以有效增加H1299细胞的放射敏感性，可以考虑作为提示患者的放射敏感性靶点，并为靶向治疗联合放疗提供更多依据。